于璐，劉衛(wèi)華，劉敏軒，楊森，王甜瑩，王向紅

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）屬氟喹諾酮類（fluoroquin-olones，F(xiàn)QNs）藥物[1]，是一種人獸共用藥，屬廣譜殺菌藥，是目前獸醫(yī)臨床應(yīng)用的氟喹諾酮類中對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌活性最強(qiáng)的一種。同時(shí)其對(duì)革蘭氏陽性菌、支原體厭氧菌、綠膿桿菌亦有較強(qiáng)的抗菌作用[2-3]。此外環(huán)丙沙星還是恩諾沙星的主要代謝產(chǎn)物。恩諾沙星同屬于氟喹諾酮類化學(xué)合成抑菌劑[4]，是一種動(dòng)物專用氟喹諾酮類廣譜抗生素，多用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療，但是恩諾沙星在動(dòng)物體內(nèi)有較長的半衰期，會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)代謝為仍有殺菌作用的環(huán)丙沙星[5-6]。有文獻(xiàn)指出給乳牛靜注2.5 mg/kg 恩諾沙星，停藥 0.5、1、2、4、6、8、24、48 h 后，乳汁中恩諾沙星濃度逐漸降低，環(huán)丙沙星濃度逐漸升高，在8 h 時(shí)達(dá)到峰值然后降低，該研究證明恩諾沙星在體內(nèi)很快被代謝為環(huán)丙沙星，后者在乳汁中將存留較長時(shí)間[7]。并且歐盟對(duì)食品中FQNs 殘留限量做了嚴(yán)格的規(guī)定，我國農(nóng)業(yè)部235 號(hào)公告也針對(duì)該類藥物制定了相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定恩諾沙星和環(huán)丙沙星共同限量100 μg/kg[8]。

隨著恩諾沙星在畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用。對(duì)恩諾沙星的代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星進(jìn)行監(jiān)測，在保障食品安全、保護(hù)人群健康等方面具有重要意義[9]，此外建立環(huán)丙沙星的檢測方法能在一定程度上反映恩諾沙星的使用情況。目前，環(huán)丙沙星殘留的檢測主要采用液相[10-11]、液相質(zhì)譜儀[12-14]和其他儀器方法[15-17]，但是儀器法價(jià)格昂貴，前處理方法復(fù)雜，需要專業(yè)的人員，不適用于大量樣本的快速篩查及現(xiàn)場篩查。免疫分析方法具有較高的靈敏度和特異性，與色譜分析方法檢測結(jié)果一致性較高，樣品前處理過程簡單，檢測時(shí)間短，不需要大型昂貴的檢測設(shè)備并且對(duì)操作人員專業(yè)性要求不高[18]。劉烜等[19]建立的膠體金免疫層析法快速喹諾酮類藥物殘留主要是針對(duì)組織樣品，未對(duì)牛奶樣品進(jìn)行檢測。何丹婷等[20]建立的牛奶中恩諾沙星和環(huán)丙沙星檢測試紙檢測限略高，因此，本研究采用膠體金作為標(biāo)記材料，采用競爭抑制原理。建立了一種高靈敏度的膠體金免疫層析法檢測牛奶樣品中的環(huán)丙沙星。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛奶：市購。

環(huán)丙沙星抗血清：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品營養(yǎng)與安全實(shí)驗(yàn)室自制；環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、依諾沙星（enoxacin，ENO）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）：上海源葉科技有限公司；氯金酸、牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS）：美國 Sigma 公司；N，N'-二環(huán)己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）：阿拉丁化學(xué)有限公司；羊抗兔IgG：北京索萊寶有限公司；硝酸纖維素膜：德國Sartorius 公司。

HM3030/HM3035 XYZ 三維劃膜噴金儀、CTD300/CTS300/CTS300B 全自動(dòng)切條機(jī)：上海金標(biāo)生物科技有限公司；JB-2 型恒溫磁力攪拌器：上海一恒電子科技有限公司；GNP-9050 恒溫培養(yǎng)箱：上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司；MK3-1500 多功能酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TDL-5 冷凍離心機(jī)：上海Anke。

1.2 方法

1.2.1 環(huán)丙沙星包被抗原的制備

稱取20.6 mg 環(huán)丙沙星溶于1 200 μL 的二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，再依次加入 15.4 mg 的NHS 和 28.1 mg 的 DCC，室溫（25 ℃）避光振蕩 5 h，放于4 ℃條件下過夜，記為A 液。稱取10.0 mg 的卵清蛋白（OVA 溶于 2 mL 0.1 mol/L NaHCO3溶液中，記為 B液。將A 液的上清液逐滴加到B 液中，使B 液一直處于冰水混合物中振搖，直到有沉淀生產(chǎn)時(shí)停止滴加，冰浴振蕩2 h 以上，然后于4 ℃條件下反應(yīng)過夜。把反應(yīng)后的混合溶液轉(zhuǎn)入透析袋中，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）（0.02 mol/L，pH7.4）進(jìn)行透析，以3 次/d 的頻率換液，連續(xù)透析3 d，透析完成后放于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 環(huán)丙沙星抗體制備及表征

采用ProteinA-sephoarse 4B 親合層析柱對(duì)環(huán)丙沙星抗血清進(jìn)行純化處理，在4 ℃條件下采用PBS 緩沖液透析3 d，可以得到接近分析純的抗體。

采用間接酶聯(lián)免疫分析（enzyme-linked Immunosorbent assay，ELSA）測定抗體效價(jià)：用碳酸鹽包被緩沖液（0.05 mol/L，pH 9.6）包被抗原，用 PBS 溶液倍比稀釋抗體，OD 值1.0 左右的抗體稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)，并作為最佳稀釋度。使用間接競爭法確定抗體IC50值：包被條件為 10 μg/mL 每孔 100 μL，標(biāo)準(zhǔn)品母液 1mg/mL，再用PBS 梯度稀釋至 100 000、10 000、1 000、100、1、0.01、0.001 ng/mL，PBS 做空白對(duì)照進(jìn)行抑制試驗(yàn)，以環(huán)丙沙星濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，建立抗體抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定抗體IC50值。抑制率計(jì)算公式如下：

抑制率（IC50）/%=[1-（OD樣品-OD空白）/（OD對(duì)照-OD空白）]×100

1.2.3 標(biāo)記材料的制備

通過用檸檬酸三鈉還原HAuCl4·3H2O 制備膠體金溶液。在恒溫加熱磁力攪拌器上加熱并攪拌，將3 mL的1 %檸檬酸三鈉儲(chǔ)備溶液加入到100 mL 沸騰的0.01%氯化金三水合物溶液中。當(dāng)混合物的顏色變?yōu)榧t色時(shí)，將混合物再煮沸5 min 冷卻至室溫（25 ℃），加入雙蒸水定容至100 mL。獲得的膠體金溶液在4 ℃下儲(chǔ)存直至進(jìn)一步使用。

1.2.4 免疫金的制備

1.2.4.1 膠體金標(biāo)記抗體蛋白最適K2CO3用量的確定

將膠體金溶液分別加入不同量的0.1 mol/L K2CO3來調(diào)節(jié)適宜的pH 值。各取100 μL 上述溶液于酶標(biāo)板中（3 個(gè)平行）同時(shí)設(shè)對(duì)照，每孔加入3 μg 環(huán)丙沙星抗體，混勻于室溫25 ℃靜置15 min，然后每孔加入20 μL 10%NaCl 溶液（對(duì)照加去離子水），混勻后于525 nm波長下測定OD 值并作圖。

1.2.4.2 膠體金標(biāo)記最佳抗體蛋白濃度的確定

分別向1 mL 已調(diào)節(jié)好pH 值的膠體金溶液中中加入不同濃度的抗體，使其終濃度分別為0、3、6、9、12、15 μg/mL，混合后加入 100 μL 10 % NaCl 溶液，反應(yīng)1 h 后于525 nm 波長下測定OD 值并作圖。

1.2.4.3 膠體金標(biāo)記抗體蛋白的制備及純化

在磁力攪拌下，然后將抗體快速加入到調(diào)節(jié)到適宜pH 值的膠體金溶液中。將混合物在室溫（25 ℃）條件下繼續(xù)攪拌10 min，然后逐滴加入20 μL 20%BSA 再攪拌10 min，將溶液在9 000 r/min 條件下離心50 min，沉淀物用 200 μL 含有 5%蔗糖、0.5%BSA、0.5%Triton-100 和0.03%疊氮化鈉的0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）重懸。將制備的金標(biāo)抗體溶液 5 μL/孔凍干在微孔板中，并在4 ℃條件下保存。

1.2.5 試紙條制備

用PBS 溶液稀釋環(huán)丙沙星包被抗原和山羊抗兔IgG 至 1、0.4 mg/mL，以 1 μL/cm 包被在硝酸纖維素膜（NC 膜）上作為檢測線（T 線）和質(zhì)控線（C 線），37 ℃干燥1 h。在PVC 膠板上依次裝貼樣品墊、NC 膜和吸水紙，用切條機(jī)裁剪成4 mm 試紙條，干燥避光保存。

1.2.6 試紙條檢出限的確定

用標(biāo)品稀釋液配制一系列濃度的環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液：1.56、3.12、6.25、12.5、25 ng/mL，取 80 μL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液用于微孔板中孵育3 min。然后加樣，觀察試紙條顯色情況，以檢測線顏色與空白對(duì)照檢測線顏色有明顯差別時(shí)的最低標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為試紙條檢出限。

1.2.7 試紙條實(shí)際樣品的檢測

1.2.7.1 樣品基質(zhì)的消除

取10 mL 牛奶置于離心管中，于3 500 r/min 離心10 min，除去脂肪，取 5 mL 依次加入 150 μL 0.36 mol/L亞鐵氰化鉀與1 mol/L 硫酸鋅，每次加入后漩渦混合振蕩5 min；3 500 r/min 離心10 min，取上清，將上清用PBS 分別稀釋 0、2、4、8 倍。

1.2.7.2 樣品添加回收試驗(yàn)

樣品牛奶經(jīng)驗(yàn)證不含環(huán)丙沙星，作為空白基質(zhì)進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。添加環(huán)丙沙星使牛奶樣品的終濃度分別為 50、25、12.5 ng/mL，在經(jīng)過 1.2.7.1 的處理，稀釋適宜的稀釋倍數(shù)，觀察回收結(jié)果。

1.2.8 ELISA 法驗(yàn)證試紙條有效性

用河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品營養(yǎng)與安全實(shí)驗(yàn)室建立的ELISA 方法對(duì)加標(biāo)牛奶樣品進(jìn)行定量檢測，以確保試紙條使用的準(zhǔn)確性和可行性。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗體的表征

純化后測得抗體濃度為1.36 mg/mL，間接ELISA 測得抗體效價(jià)為1 ∶6 400，抗體IC50值為135.64 ng/mL。競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。該抗體與交叉反應(yīng)結(jié)果見表1。

圖1 環(huán)丙沙星間接競爭ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=3）Fig.1 Standard curves for CIP in indirect competitive ELISA（n=3）

表1 環(huán)丙沙星及3 種結(jié)構(gòu)類似物的IC50 值和交叉反應(yīng)率Table 1 IC50 and cross-reactivity values for three structural analogues of CIP with the icELISA method

環(huán)丙沙星與其結(jié)構(gòu)類似物均未見明顯的交叉反應(yīng)，故使用抗體進(jìn)行后續(xù)免疫層析試驗(yàn)。

2.2 標(biāo)記材料的質(zhì)量鑒定

本試驗(yàn)制備的膠體金澄清透明，呈酒紅色，表面無漂浮物，可初步得知所制備的膠體金顆粒大小均勻，質(zhì)量較好。

2.3 膠體金與環(huán)丙沙星抗體最適pH 值的確定

由于膠體金會(huì)對(duì)pH 計(jì)造成損壞，所以本文用K2CO3溶液的用量來代表pH 值，既能方便表達(dá)還能有效的調(diào)節(jié)pH 值。如圖2 所示，1 mL 膠體金溶液與抗體結(jié)合最適K2CO3的用量為25 μL。

圖2 最佳標(biāo)記pH 值選擇Fig.2 Best mark pH value selection

2.4 膠體金與環(huán)丙沙星抗體最適蛋白量的確定

1 mL 膠體金溶液所需要的環(huán)丙沙星抗體最適量見圖3。

圖3 標(biāo)記最佳蛋白量的選擇Fig.3 Selection of labeled optimum protein

當(dāng)抗體蛋白用量小于9 μg 時(shí)，吸光值隨著抗體蛋白用量的增大而增加；當(dāng)抗體蛋白用量等于或大于9 μg/mL 時(shí)，吸光度值趨于平衡。即抗體蛋白用量為9 μg/mL 時(shí)，與膠體金結(jié)合最佳。

2.5 試紙條檢出限的確定

配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用優(yōu)化出的最佳條件組裝試紙條，隨著標(biāo)準(zhǔn)品濃度的升高，試紙條檢測線顏色逐漸變淺直至消線。標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次是25、12.5、6.25、3.12、1.56、0 ng/mL，膠體金標(biāo)記抗體的試紙條結(jié)果如圖4 所示。

圖4 環(huán)丙沙星膠體金試紙條檢出限的確定Fig.4 The detection limit of colloidal gold strips for CIP

當(dāng)濃度為6.25 ng/mL 時(shí)，與對(duì)照試紙條檢測線顏色有明顯差別，檢測線顏色隨著環(huán)丙沙星添加濃度的增大而逐漸變淺。當(dāng)濃度為12.50 ng/mL 時(shí)，T 線完全消失。經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定所建立的膠體金標(biāo)記免疫層析試紙條方法在實(shí)際樣品中的檢出限為6.25 ng/mL。

圖5 樣品不同稀釋倍數(shù)顯色結(jié)果Fig.5 The resulits of different dilution for the milk

2.6 試紙條實(shí)際樣品的檢測

2.6.1 樣品基質(zhì)的消除

樣品不同稀釋倍數(shù)的顯色結(jié)果見圖5。

經(jīng)過1.2.7.1 處理的牛奶樣品不經(jīng)稀釋會(huì)導(dǎo)致試紙條失效，用PBS 稀釋2、4、8 倍試紙條條帶顯色清晰，顯色效果與對(duì)照接近，即基質(zhì)影響已基本消除。由于稀釋倍數(shù)會(huì)影響樣品檢測的靈敏度，所以選用2 倍稀釋作為最終的稀釋倍數(shù)以消除樣品基質(zhì)的影響。

2.6.2 實(shí)際樣品的測定

向牛奶陰性樣品中分別添加環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)品使其終濃度為分別為 25.00、12.50、6.25、0 ng/mL，按要求對(duì)樣品處理后進(jìn)行檢測，每份樣品重復(fù)3 次，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 牛奶樣品添加回收結(jié)果Fig.6 The recovery experiments result of spiked milk

當(dāng)加標(biāo)濃度為12.50 ng/mL 時(shí)與對(duì)照有明顯的差異，25.00 ng/mL 時(shí)T 線完全消失，所以牛奶樣品的最低檢出限為12.50 ng/mL。

2.7 ELISA 法驗(yàn)證試紙條有效性

通過將ELISA 方法和試紙條結(jié)果相比較，從而驗(yàn)證試紙條的準(zhǔn)確性。結(jié)果如表2 所示，試紙條在檢測范圍內(nèi)與ELISA 方法保持一致，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 牛奶中不同環(huán)丙沙星添加水平ELISA 結(jié)果與試紙條測定結(jié)果比較Table 2 Comparation of results obtained by ELISA and strips at three spiked level

3 討論與結(jié)論

環(huán)丙沙星屬于小分子物質(zhì)，采用競爭抑制法對(duì)其進(jìn)行檢測，建立環(huán)丙沙星膠體金免疫層析的方法。本文制備環(huán)丙沙星包被抗原，對(duì)環(huán)丙沙星抗體進(jìn)行表征，優(yōu)化膠體金標(biāo)記條件，選用最佳標(biāo)記pH 值為7.5左右，即需要添加25 μL 0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH 值，最佳蛋白添加量為9 μg/mL。方法對(duì)牛奶樣品的檢出限為12.50 ng/mL。該試紙條成本低廉，穩(wěn)定性良好，樣品前處理簡單，點(diǎn)樣后10 min 后裸眼即可判定結(jié)果，檢測結(jié)果和ELISA 方法一致，故本研究開發(fā)的免疫層析試紙條可用于現(xiàn)場快速篩查。