吳燕，伏二偉，桑學財，馬曉軍

（江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

漿水菜是我國陜西、甘肅、山西、河南等地的一種傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜[1]。傳統(tǒng)做法一般采用面粉和蔬菜為原料，加入漿水引子后，經其中的多種微生物菌群發(fā)酵而成。其氣味清香、口味酸醇，且含有豐富的營養(yǎng)成分，具有諸多的益生功效[2]，如：調理腸胃、提高食欲、消暑止渴等。一般情況下，漿水發(fā)酵過程需要經過初、中、后期3 個階段，每個階段均包含著復雜的微生物群系，但其中最主要的發(fā)酵菌群為乳酸菌[1]。張勇等[3]對陜西傳統(tǒng)發(fā)酵漿水中的微生物群系進行探究并從中分離鑒定出18 株乳酸菌。李雪萍[4]從西北不同的5 個地區(qū)的漿水樣品中共分離純化得到107 株菌，并對所分離菌種進行鑒定、分析其多樣性。張曉輝等[5]對3 個不同地方采集的漿水中的細菌多樣性進行研究，得知乳桿菌在3 種漿水中為優(yōu)勢菌，且3 種漿水中的細菌多樣性存在差異。

隨著對乳酸菌研究的不斷深入，許多學者發(fā)現其不僅具有調整胃腸道菌群平衡、提高食物消化率的功效[6]，還能夠有效降低腸道的膽固醇含量、改善腸道環(huán)境[7-8]，因此被廣泛用于發(fā)酵食品的加工過程，來抑制食品中腐敗菌的生長、延長貨架期、提高食品的品質及風味[6]。且乳酸菌大多可以產生抑菌物質，具有抗菌活性，因此被廣泛用于發(fā)酵食品的加工過程，抑制食品中腐敗菌的生長，延長貨架期，并對食品的品質及風味進行改善[9-10]。雖然近年來我國科研人員對漿水這一傳統(tǒng)發(fā)酵食品的研究逐漸深入，但主要集中于對其菌群情況的研究，對漿水中乳酸菌抑菌性能的研究并不多見。

本研究以甘肅天水周邊為采樣地點，從傳統(tǒng)發(fā)酵漿水中提取具有抑菌活性的乳酸菌株，并篩選出產蛋白質類細菌素的乳酸菌，觀察并研究其形態(tài)、生長特性，進行乳酸菌的分子生物學鑒定。為之后提純抑菌成分、開發(fā)新型抑菌制劑及發(fā)酵食品提供借鑒和基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漿水來自農家自制及市售；MRS 肉湯培養(yǎng)基、MRS 瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）標準菌株由江南大學谷物與淀粉研究中心實驗室保存；木瓜蛋白酶（酶活力600 U/mg）、蛋白酶K（酶活力 30 U/mg）、胰蛋白酶（酶活力 10 U/mg）、胃蛋白酶（酶活力3 U/mg）、過氧化氫酶（酶活力200 U/mg）：TaKaRa 公司；草酸銨結晶紫染色液、盧氏碘液、番紅復染液：江南大學谷物與淀粉研究中心實驗室自配。

1.2 儀器與設備

BCD-208BSC 冰箱：青島海爾股份有限公司；YXJ-2 臺式離心機：湘儀離心機儀器有限公司；ZA100R3 電子天平：上海贊維衡器有限公司；SW-CJ-1F 超凈工作臺：蘇州尚田潔凈技術有限公司；HZQ-X100A 電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；U-3010 紫外分光光度計：Hitachi 公司；Zeiss AxioVert.A1 熒光倒置顯微鏡：蔡司中國；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌富集培養(yǎng)

向MRS 液體培養(yǎng)基中加入適量漿水樣品，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h。

1.3.2 乳酸菌的分離純化

用無菌生理鹽水對富集培養(yǎng)后的菌液進行稀釋，稀釋度為10-1～10-7。采用稀釋混勻平板法，分別吸取0.1 mL 稀釋度為 10-4、10-5、10-6、10-7的菌懸液注入培養(yǎng)皿，將50 ℃左右的碳酸鈣MRS 瓊脂培養(yǎng)基倒入皿中，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將其轉移至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。篩選鈣溶圈較大的菌落，在MRS 固體培養(yǎng)基上反復劃線純化、鏡檢，得到純菌落。將純化菌株接種于MRS 斜面培養(yǎng)基中，繼續(xù)于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后保存于4 ℃低溫冰箱中。

1.3.3 乳酸菌的形態(tài)學觀察

菌落形態(tài)：采用平板劃線法，將純化的乳酸菌劃線于MRS 固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察并記錄菌落顏色和外形特征。

菌體形態(tài)：取培養(yǎng)24 h 的乳酸菌體進行革蘭氏染色、制片，在顯微鏡下觀察染色結果及乳酸菌形態(tài)。

1.3.4 生長曲線測定

按2 %的接種量將預先活化好的乳酸菌液加入MRS 培養(yǎng)液中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。每隔2 h 取發(fā)酵液，以未接菌的MRS 液體培養(yǎng)基作對照，在600 nm 波長處測定其吸光值（OD600nm），平行測定3 次，繪制各菌株生長曲線。

1.3.5 pH 值的測定

采用pH 計測定。將預先活化好的乳酸菌按2%的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，每隔2 h 測定發(fā)酵液的pH 值，平行測定3 次。

1.3.6 耐酸試驗

參考王俊國[11]的方法，制備人工胃液：取稀鹽酸16.4 mL，加 800 mL 水、10 g 胃蛋白酶，搖勻后加水至1 000 mL，用0.23 μm 的無菌濾頭在無菌操作臺中除菌過濾待用，于無菌試劑瓶中低溫保藏備用。取活化好的菌株培養(yǎng)液5 mL，4 000 r/min 離心10 min 后棄上清，向菌體中加入5 mL 無菌生理鹽水，混勻制成菌懸液，取1.0 mL 菌懸液與9.0 mL pH3.0 的人工胃液混合后，置 37 ℃培養(yǎng)，于 0 h、3 h 取樣，采用平板計數法，用MRS 固體培養(yǎng)基傾注，于37 ℃培養(yǎng)48 h 后計活菌數，按公式（1）計算存活率。

式中：A 為 3 h 的活菌數，CFU/mL；B 為 0 h 的活菌數，CFU/mL。

1.3.7 耐膽鹽試驗

選取在耐酸試驗中存活率大于10%的乳酸菌進行膽鹽耐受性試驗[11]。在含0.10%牛膽鹽、0.30%牛膽鹽）的MRS-THIO 培養(yǎng)基中添加2%的活化好的乳酸菌液，置37 ℃培養(yǎng)，于0、3 h 取樣，采用和耐酸性試驗相同的方法，按公式（1）計算存活率（%）。

1.3.8 抑菌試驗

1.3.8.1 指示菌菌懸液的制備

將指示菌金黃色葡萄球菌接種到MRS 液體培養(yǎng)基中，將枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌接種到普通肉湯培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)24 h，離心，配制菌懸液。采用平板計數法計量菌懸液的菌含量，取菌液濃度105CFU/mL 的菌液作為指示菌懸液。

1.3.8.2 乳酸菌代謝產物的制備

將半固體保存的菌株接種到MRS 液體培養(yǎng)基內傳兩代培養(yǎng)。取第3 代培養(yǎng)液，4 000 r/min 離心15 min，收集上清液，經細菌過濾器過濾制成無菌濾液，所得無菌濾液即為乳酸菌的代謝產物。

1.3.8.3 乳酸菌代謝產物抑菌試驗

使用牛津杯法測定抑菌圈大小[12]，指示菌分別為蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌（105CFU/mL）。

1.3.8.4 代謝產物酸堿處理后的抑菌效果

用1 mol/L 的 NaOH、HCl 將代謝產物的 pH 值分別調至 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，進行抑菌試驗，采用1.3.8.3 中提到的方法測定抑菌圈大小，指示菌為蠟狀芽孢桿菌。用乳酸溶液、1 mol/L 的NaOH 將MRS 液體培養(yǎng)基的 pH 值調至 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 做對照試驗。

1.3.8.5 代謝產物熱處理后的抑菌效果

將代謝產物在沸水浴中處理30 min，進行抑菌試驗，用未處理的代謝產物作對照組。

1.3.8.6 代謝產物酶處理后的抑菌效果

取 1 mL 的代謝產物，用 1 mol/L 的 NaOH、HCl 將代謝產物的pH 值分別調至各酶最適范圍，加入蛋白酶 K（0.5 mg/mL）、胃蛋白酶（0.5 mg/mL）、胰蛋白酶（0.5 mg/mL）、木瓜蛋白酶（0.5 mg/mL）、過氧化氫酶（0.5 mg/mL）適量，于37 ℃水浴2 h，然后調代謝產物pH 值至初始值，進行抑菌試驗，使用未經酶處理的代謝產物作對照組。

1.3.9 乳酸菌菌株的鑒定

1.3.9.1 提取DNA

乳酸菌的基因組DNA 的提取采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammoniumbromide，CTAB）法[13]。

1.3.9.2 乳酸菌16SrDNA 的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增與測序

擴增程序為：94 ℃預變性 4 min、94 ℃變性 45 s、56 ℃退火 1 min、72 ℃延伸 1 min，30 個循環(huán)、72 ℃延伸10 min[14-15]；模板：乳酸菌菌株基因組 DNA；引物：27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和 1495r（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA）[16]。

擴增程序完成后，對PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證，之后純化目標條帶并送至上海桑尼生物科技有限公司測序。

1.3.9.3 同源性分析

使用核酸基于局部比對算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）技術，將上一步測得的PCR 擴增產物序列對比NCBI 網站里的GeneBank數據庫中的序列信息，檢索得到與所測序列同源性最高的已知分類地位的菌種。

1.3.9.4 數據統(tǒng)計分析

使用SPSS22 統(tǒng)計軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化及形態(tài)學觀察

從傳統(tǒng)發(fā)酵漿水中分離出乳酸菌6 株。革蘭氏染色特性、菌落形態(tài)及細胞形態(tài)是細菌種屬鑒定的重要依據，不同的細菌種屬會得到不同的革蘭氏染色結果，且其在培養(yǎng)基表面呈現出的菌落形態(tài)及顯微鏡下觀察到的細胞形態(tài)也不同。本研究純化后得到的菌株的菌落形態(tài)及革蘭氏染色特性如表1 所示。

表1 漿水樣品中分離出的各乳酸菌的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結果Table 1 Colony morphology and Gram staining results of each lactic acid bacteria isolated from Jiangshui celery

從表1 可以看出，傳統(tǒng)發(fā)酵漿水中分離純化得到的乳酸菌菌落均呈圓形、白色，表面多光滑濕潤。革蘭氏染色觀察，發(fā)現菌株均呈桿狀，為長桿狀或短桿狀，與武帥帥、李良鳳等在漿水菜中觀察到的可培養(yǎng)乳酸菌的菌體形態(tài)相似[17-18]。圖1 為菌株SJ-3 的顯微圖像。

圖1 菌株SJ-3 的革蘭氏染色（×1000）Fig.1 Gram staining of strain SJ-3（×1000）

2.2 乳酸菌的生物學特性

2.2.1 乳酸菌的生長曲線及產酸能力

6 株乳酸菌的生長曲線見圖2。

圖2 6 株乳酸菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of 6 strains

由圖2 可知，隨著培養(yǎng)時間增加，6 株菌的生長趨勢相似。0～6 h SJ-3 處于遲滯期，其他5 株乳酸菌在0～4 h 處于遲滯期；SJ-1、SJ-5 在 4 h～16 h 處在對數生長期，SJ-2、SJ-6 在 4 h～14 h 為對數生長期，SJ-3、SJ-4分別在 6 h～20 h 和 4 h～18 h 處于對數生長期。SJ-2、SJ-6 于 14 h 后進入穩(wěn)定期，SJ-1、SJ-5 在 16 h 后進入穩(wěn)定期，SJ-3、SJ-4 則分別在 20 h 和 18 h 后進入穩(wěn)定期。在相同培養(yǎng)時間內，菌株SJ-4 的菌液濃度最大、繁殖能力最強，其次為菌株SJ-5、SJ-6，而菌株SJ-3 的生長速率明顯較慢。

6 株乳酸菌的pH 值測定結果見圖3。

圖3 6 株乳酸菌的pH 值曲線Fig.3 pH value curves of 6 strains

由圖 3 可以看出，菌株 SJ-1、SJ-2、SJ-3、SJ-4、SJ-5 培養(yǎng)液的 pH 值在 2 h～14 h 內迅速下降，SJ-6 培養(yǎng)液的pH 值在8 h～16 h 內迅速下降，隨后pH 值下降緩慢直至趨于平穩(wěn)，最終pH 值分別達到3.50、3.78、3.86、3.68、3.71。綜合比較發(fā)現，六株乳酸菌中 SJ-1 的產酸能力較強。

2.2.2 乳酸菌的耐酸耐膽鹽能力

6 株乳酸菌的耐酸能力見圖4。

圖4 6 株乳酸菌的耐酸能力Fig.4 Acid resistance of 6 strains

6 株乳酸菌都能耐受pH3.0 的人工胃液，其中SJ-3、SJ-5 的存活率在 50 %以上，SJ-2、SJ-3、SJ-5、SJ-6的存活率在30 %以上，除SJ-4 以外，其他菌株的存活率都在10 %以上，其中SJ-5 的存活率最大，可達75%。選擇在pH3.0 人工胃液中存活率在10%以上的5 株乳酸菌做不同膽鹽濃度下的生長測試。

5 株乳酸菌的耐膽鹽能力見圖5。

圖5 5 株乳酸菌的耐膽鹽能力Fig.5 Bile resistance of 5 strains

由圖5 可知，5 株乳桿菌對0.1%膽鹽有一定的耐受力，除SJ-6 的存活率僅有0.21%，其他4 株菌的存活率均在70%以上。當膽鹽濃度升高至0.3%時，乳酸菌的存活率明顯降低，SJ-1、SJ-2、SJ-3 的存活率分別只有1.00%、0.01%和0.88%。

2.3 具有抑菌活性乳酸菌的篩選

牛津杯法測定抑菌圈大小見圖6，6 株乳酸菌代謝產物的抑菌活性結果如表2 所示。

從表2 可以看出，6 株乳酸菌的代謝產物的抑菌效果。從表2 可知，6 株乳酸菌對指示菌均顯示了抗菌活性。對蠟狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，SJ-1 顯示了較強的抑菌活性，抑菌圈直徑分別約為24.2、17.3 mm；SJ-3 對大腸桿菌的抑菌圈直徑約為10.4 mm，表現出較強的抑菌活性；SJ-6 相比其他5 個菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌活性顯著更高，抑菌圈直徑約為13.8 mm。對表2 中的結果進行綜合分析可知，SJ-6 對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑是最大的，SJ-1 和SJ-6 對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑也沒有顯著差異，因此SJ-6 抑菌效果更好。

圖6 牛津杯法測定抑菌圈大小Fig.6 Determination of the size of the zone of inhibition by the Oxford cup method

表2 乳酸菌代謝產物的抑菌圈直徑Table 2 Dialysis zone diameters of lactic acid bacteria metabolites mm

2.4 代謝產物酸堿處理后的抑菌活性測定

以蠟狀芽孢桿菌為指示菌，不同pH 值代謝產物的抑菌活性見表3。

表3 乳酸菌代謝產物調不同pH 值后的抑菌圈直徑Table 3 Dialysis zone diameters of lactic acid bacteria metabolites adjusted to different pH value mm

分析表3 數據可知，pH 值大小會對乳酸菌代謝產物的抑菌活性產生顯著影響。當pH 值小于7 時，代謝產物抑菌活性隨pH 值的升高而降低，當pH 值為2.0、3.0、4.0 時，6 株乳酸菌的代謝產物均對蠟狀芽孢桿菌表現出有抑菌活性，當 pH 值升高至5 時，SJ-3、SJ-4、SJ-5、SJ-6 與對照組的乳酸均失去抑菌活性，只有SJ-1、SJ-2 的代謝產物仍保持抑菌活性。

從試驗結果可以看出，SJ-3、SJ-4、SJ-5、SJ-6 這 4株菌代謝產物中包含有機酸類抑菌成分，或可能含有依賴有機酸產生抑菌作用的其他成分。而SJ-1、SJ-2代謝產物中除有機酸外仍含其他抑菌成分。

以蠟狀芽孢桿菌為指示菌，SJ-1、SJ-2 代謝產物在100 ℃下保持30 min 的抑菌活性見表4。

2.5 代謝產物熱處理后的抑菌活性測定

表4 乳酸菌代謝產物熱處理后的抑菌圈直徑Table 4 Dialysis zone diameters of lactic acid bacteria metabolites after heat treatment mm

分析比較表4 數據可知，代謝產物在沸水浴中處理30 min 后，SJ-1、SJ-2 菌株的抑菌圈大小沒有發(fā)生明顯的改變，表明熱處理不會對其抑菌活性產生影響，抑菌成分具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.6 代謝產物酶處理后的抑菌活性測定

以蠟狀芽孢桿菌為指示菌，酶處理后的菌株SJ-1、SJ-2 代謝產物抑菌活性如表5 所示。

表5 乳酸菌代謝產物酶處理后的抑菌圈直徑Table 5 Dialysis zone diameters of lactic acid bacteria metabolites after enzyme treatment mm

從表5 可以看出，經過氧化氫酶處理后，菌株SJ-1、SJ-2 代謝產物抑菌活性分別降低了12%和29%，說明代謝產物中包含過氧化氫作為抑菌成分；排除過氧化氫的干擾后，代謝產物仍具有抑菌活性，因此判定代謝產物中還含有其他成分的抑菌物質。代謝產物經蛋白酶K 處理后，抑菌活性分別降低了31%、43%；胃蛋白酶處理后分別降低了14%、40%；木瓜蛋白酶處理后分別降低了15%、30%；胰蛋白酶處理后降低了13%、35%。說明菌株代謝產物中的抑菌物質對蛋白酶敏感，所以極有可能是一種蛋白類抑菌物質。

2.7 乳酸菌16SrDNA 序列分析

對乳酸菌SJ-1、SJ-2 進行擴大培養(yǎng)、提取基因組DNA、擴增16SrDNA 保守序列，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗證得兩菌株的保守序列大小相同，約為1 500 bp，結果見圖7。

圖7 來源于漿水樣品的2 株乳酸菌的16SrDNA 擴增產物Fig.7 16SrDNA amplification products of 2 strains of lactic acid bacteria derived from Jiangshui celery

將測得的2 株菌的PCR 擴增產物序列與NCBI 在線數據庫比對發(fā)現，SJ-1 與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）的16SrDNA 的相似性達100%、SJ-2 與的植物乳桿菌（Lactococcus plantarum）16SrDNA 的相似性達99%，表6 即為基因序列的比對結果。

表6 分離菌株16SrDNA 基因序列與GenBank 已知菌序列的相似性比較Table 6 Comparison of similarity between 16SrDNA gene sequences of isolated strains and known sequences of GenBank

3 結論與討論

本研究從漿水中分離出6 株乳酸菌，觀察其形態(tài)特征，研究其生長曲線、產酸能力、耐酸耐膽鹽能力，并從中篩選具抑菌活性的菌株。結果表明：分離純化得到的乳酸菌菌落均呈圓形、白色、表面多光滑濕潤，呈革蘭氏陽性，在顯微觀察下菌體呈長桿狀或短桿狀。在相同培養(yǎng)時間內，菌株SJ-4 的繁殖能力最強；菌株SJ-1 最終pH 值最低，產酸能力最強；菌株SJ-3、SJ-5表現出較好的耐酸能力，大部分的菌株對0.1%的膽鹽表現出較好的耐受力，但當膽鹽濃度升至0.3%，乳酸菌存活率大幅下降。菌株SJ-1、SJ-2 代謝產物排除酸抑制作用和過氧化氫抑制作用及熱處理后依然維持較高的抑菌活性，而經蛋白酶處理后，抑菌活性明顯降低。表明其中存在一種蛋白質類的抑菌物質。對菌株SJ-1、SJ-2 進行16SrDNA 分子生物學鑒定，菌株SJ-1 屬于發(fā)酵乳桿菌屬（Lactobacillus fermentum strain）、SJ-2 屬于植物乳桿菌屬 （Lactobacillus plantarum strain）。

近年來，國內外有不少關于產蛋白質類抑菌物質乳酸菌的研究報道，如LGG（Lactobacillus rhamnosus GG）、ZJ19[19]和 KCA386[20]，對李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌和多數乳酸菌有抑制作用。本實驗從甘肅傳統(tǒng)漿水中篩選出2 株具有抑菌活性的乳酸菌，探究了其抑菌菌株 SJ-1（Lactobacillus fermentum strain）、SJ-2（Lactobacillus plantarum strain）產生的蛋白類抑菌物質，能對常見的金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌等致病菌、腐敗菌產生抑制效果，使其有可能作為病原微生物與食物腐敗菌的天然屏障[21]并廣泛應用到食品防腐保鮮加工業(yè)中。后續(xù)需要繼續(xù)分離純化菌株SJ-1、SJ-2 所產生的抑菌物質，并充分評估其生物學活性和安全性，以期能夠開發(fā)出新型的天然防腐劑。