叢媛媛，阿依江·哈拜克，米仁沙·牙庫(kù)甫，帕麗達(dá)·阿不力孜

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊830011）

阿魏菇，學(xué)名阿魏側(cè)耳（Pleurotus ferulae Lanzi），亦名準(zhǔn)噶爾阿魏側(cè)耳（Pleuratus eryngii（Dc.：ex.Fr.）Quel.var.ferulae Lanzi），隸屬于真菌門擔(dān)子菌綱傘綱目口蘑科（Tricholomataceae）側(cè)耳屬（Pleurotus（fr.）kumm.），在我國(guó)野生阿魏菇僅分布于新疆木壘、塔城、阿勒泰和青河等地的沙漠戈壁里，是寄生或腐生在新疆荒漠藥用植物阿魏（Ferula sinkiangensis K.M.Shen）上的一種具有藥用價(jià)值的珍稀食用菌[1-2]。過(guò)去由于過(guò)度采摘和牲畜踐踏，自然資源遭受嚴(yán)重破壞，野生阿魏菇逐年減少。直至1983 年，新疆生物沙漠土壤研究所馴化栽培了阿魏菇，并于1990 年選育出高產(chǎn)菌株，其后在新疆和福建等省區(qū)推廣并進(jìn)行了較大規(guī)模的生產(chǎn)[3]。阿魏菇具有很高的食用和藥用價(jià)值，其子實(shí)體脆嫩可口，香味濃郁；又因其具有行氣、消積、殺蟲等功效，中醫(yī)可用于治療胃痛、食積、蟲積等[4]，國(guó)外學(xué)者則報(bào)道阿魏菇的子實(shí)體具有抗高血脂、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性[5-7]。對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究則表明，阿魏菇中含有的多糖（Pleurotus ferulae polysaccharides，PfP），是與其藥效密切相關(guān)的一類重要化學(xué)成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等藥理活性[8-13]。

為了進(jìn)一步研究阿魏菇多糖PfP 的結(jié)構(gòu)及活性，傳統(tǒng)水浴浸提法[14]、超聲波法[15]等提取方法多用于PfP的提取，但采用響應(yīng)面法優(yōu)化PfP 的超聲輔助提取工藝的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期采取水提醇沉方法提取了PfP，對(duì)其急性毒性和抗炎作用進(jìn)行了初步研究[13]，并采用薄層色譜法和氣相色譜法PfP 的單糖組成進(jìn)行了分析[16]。本文以新疆地產(chǎn)阿魏菇為研究對(duì)象，選擇超聲時(shí)間、超聲溫度、液料比及提取次數(shù)對(duì)多糖提取率有影響的4 個(gè)因素，以阿魏菇多糖的提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)；并在此基礎(chǔ)上采用中心組合設(shè)計(jì)（box-behnken design，BBD）和響應(yīng)面方法（response surface methodology，RSM），對(duì)超聲輔助法提取阿魏菇多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)對(duì)所提取的PfP 從還原能力、清除DPPH 自由基、羥基自由基等方面進(jìn)行體外抗氧化活性研究，為今后進(jìn)一步研究阿魏菇多糖的綜合開(kāi)發(fā)利用積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

阿魏菇：新疆紅杏生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)·阿不力孜鑒定為阿魏側(cè)耳（Pleurotus ferulae Lanzi）。

DPPH、葡萄糖：美國(guó)Sigma 公司；抗壞血酸：上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、水楊酸：天津永晟精細(xì)化工有限公司；苯酚：天津市鼎盛鑫化工有限公司；硫酸、乙醇：天津福晨化學(xué)試劑廠。以上試劑均為分析純。

T6 新世紀(jì)型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Sartorius AL104 電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ5200DE 型超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 阿魏菇多糖超聲輔助提取工藝

阿魏菇干燥、粉碎后，取適量粉末加入一定量水進(jìn)行超聲處理，提取數(shù)次，合并提取液后過(guò)濾，濾液濃縮至一定體積，加數(shù)倍量體積的無(wú)水乙醇沉淀過(guò)夜，離心后取沉淀干燥即為阿魏菇多糖。多糖的含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[17]，多糖的提取率用下式計(jì)算：

阿魏菇多糖提取率/%=阿魏菇多糖質(zhì)量（g）/阿魏菇干質(zhì)量（g）×100。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

在超聲時(shí)間分別為 10、20、30、40、50 min，超聲溫度分別為 20、30、40、50、60 ℃，液料比分別為 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g），提取次數(shù)分別為 1、2、3、4、5 的條件下，按照 1.2.1 的方法和多糖提取率計(jì)算方法，進(jìn)行超聲時(shí)間、超聲溫度、液料比、提取次數(shù)4個(gè)因素對(duì)阿魏菇多糖提取率的影響試驗(yàn)。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化阿魏菇多糖的超聲提取工藝的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用BBD 和RSM 方法，對(duì)超聲輔助法提取阿魏菇多糖的影響因素進(jìn)行研究和條件優(yōu)化，做出響應(yīng)面圖，建模并分析各因素對(duì)響應(yīng)值的影響[18-20]。

1.2.4 阿魏菇多糖體外抗氧化活性研究

1.2.4.1 阿魏菇多糖還原能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[21-22]，采用鐵氰化鉀還原法測(cè)定阿魏菇多糖還原能力：取PfP 適量，用蒸餾水配成0.5 mg/mL～4.0 mg/mL 梯度的溶液，取 1 mL 待測(cè)液，加入 pH6.6 的磷酸鹽緩沖液2.5 mL 和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合后在50 ℃放置20 min，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，4 800 r/min 離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.1%氯化鐵2.5 mL，混勻，靜置10 min，在700 nm 處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3 次，取平均值。同時(shí)測(cè)定VC的還原能力，作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4.2 阿魏菇多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn) [21-22]，取各濃度阿魏菇多糖溶液（0.5 mg/mL～4.0 mg/mL）2mL 及 1×10-4mol/L DPPH 溶液2 mL 加入具塞試管中搖勻，在室溫（23 ℃）下密閉靜置30 min，用純?nèi)軇┳鲄⒈?，?17 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3 次，取平均值。同時(shí)測(cè)定VC的DPPH 自由基清除能力，作為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)下列公式計(jì)算每種提取液對(duì)DPPH 自由基的清除率：

式中：A1為加多糖溶液后DPPH 溶液的吸光度；A2為多糖溶液的吸光度；A0為未加多糖溶液時(shí)DPPH 溶液的吸光度。

1.2.4.3 阿魏菇多糖對(duì)羥自由基（·OH）的清除試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[23-24]，利用鄰二氮菲法，精確移取1 mL 0.75 mmol/L 的鄰二氮菲溶液、2 mL pH 7.4 的磷酸鹽緩沖溶液和1mL 雙蒸水，搖勻，再加入1 mL 0.75 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液，搖勻，最后再加入1 mL 0.01%過(guò)氧化氫溶液，37 ℃恒溫水浴60 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，記作A損；另一比色管中用1 mL雙蒸水代替1 mL 過(guò)氧化氫，測(cè)定其吸光度，記作A未；再在一比色管中用不同濃度的VC對(duì)照溶液或阿魏菇多糖溶液（0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 mg/mL）代替 1 mL 雙蒸水，在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，記作A樣，平行測(cè)定3 次，取平均值，按下式計(jì)算其清除率：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)阿魏菇多糖提取率的影響

在液料比 20 ∶1（mL/g）、超聲溫度 60 ℃、提取兩次的條件下，超聲時(shí)間對(duì)阿魏菇多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)阿魏菇多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of PfP

由圖1 可知，PfP 的提取率在提取時(shí)間10 min 至50 min 之間呈逐漸上升的趨勢(shì)，在30 min 時(shí)提取率達(dá)到最高（13.41%），之后趨于下降。表明超聲時(shí)間在一定范圍內(nèi)可以增加PfP 提取率，但長(zhǎng)時(shí)間的超聲波作用可能會(huì)使大分子的多糖結(jié)構(gòu)破壞，影響了提取率，因此選擇超聲時(shí)間30 min 作為BBD 試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.1.2 超聲溫度對(duì)阿魏菇多糖提取率的影響

在液料比 20 ∶1（mL/g）、超聲時(shí)間 30 min，提取兩次的條件下，超聲溫度對(duì)阿魏菇多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 超聲溫度對(duì)阿魏菇多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temprature on the extraction rate of PfP

由圖2 可知，PfP 的提取率在超聲溫度20 ℃至60 ℃之間呈逐漸上升的趨勢(shì)，在60 ℃時(shí)提取率達(dá)到最高（11.89%）。表明在一定范圍內(nèi)，超聲溫度越高，PfP 提取率越大。因此選擇超聲溫度60 ℃作為BBD 試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.1.3 液料比對(duì)阿魏菇多糖提取率的影響

在超聲時(shí)間30 min、超聲溫度60 ℃、提取兩次的條件下，液料比對(duì)阿魏菇多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 液料比對(duì)阿魏菇多糖提取率的影響Fig.3 Effect of liquid/solid on the extraction rate of PfP

由圖 3 可知，PfP 的提取率在液料比 10∶1（mL/g）至25∶1（mL/g）之間逐步增大，當(dāng)料液比達(dá)到 25∶1（mL/g）時(shí)，PfP 提取率達(dá)到最大值（11.55%）；其后當(dāng)料液比達(dá)到 30∶1（mL/g）時(shí)，PfP 提取率反而下降（10.77%）。因此選擇液料比25∶1（mL/g）作為BBD 試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)阿魏菇多糖提取率的影響

在液料比 25∶1（mL/g）、超聲時(shí)間 30 min、超聲溫度60 ℃的條件下，提取次數(shù)對(duì)PfP 提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取次數(shù)對(duì)阿魏菇多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on the extraction rate of PfP

從圖4 可知，提取2 次即達(dá)到較好的效果，PfP 提取率為10.37%；3、4 次提取與2 次提取的提取率相比則有下降的趨勢(shì)。因此選擇兩次提取作為BBD 試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.2 阿魏菇多糖提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

根據(jù)BBD 原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果確定超聲溫度（X1）、液料比（X2）、超聲時(shí)間（X3）3 個(gè)因素的水平范圍，將PfP 提取率作為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in response surface design

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experiment design and results

續(xù)表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2 Response surface experiment design and results

采用Design-Expert8.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)擬合回歸，建立模型為：

Y=14.23+0.27X1+0.63X2+0.095X3+0.16X1X2+0.11X1X3-0.11X2X3-0.44X12-0.32X22-0.32X32

回歸模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for quadric regression model

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，模型的F 值為13.19（P＜0.01），表明該模型極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬誤差項(xiàng)的 P 值為 0.088＞0.05，且 R2=0.891 7，不顯著。該結(jié)果顯示模型的二次多項(xiàng)回歸方程可以在不同提取條件下預(yù)測(cè)PfP 的提取率，試驗(yàn)方法可靠。表3 結(jié)果還表明，各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是線性關(guān)系，作用顯著的是模型中的一次項(xiàng)X2、X1和二次項(xiàng)X12、X22、X32，表明該試驗(yàn)的各因素對(duì)PfP 提取率有顯著影響。由F 值可知，對(duì)PfP 提取率影響的大小依次為液料比、超聲溫度和超聲時(shí)間，即液料比對(duì)PfP 提取率的影響最為顯著。

圖5～7 為通過(guò)回歸模型而得到的PfP 提取率的響應(yīng)曲面圖和等高線圖。

圖5 超聲溫度和液料比對(duì)PfP 提取率交互影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.5 Response and contour plot of synergetic effect of ultrasonic temprature and liquid/solid on the extraction rate of PfP

圖6 超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)PfP 提取率交互影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.6 Response and contour plot of synergetic effect of ultrasonic temprature and ultrasonic time on the extraction rate of PfP

圖7 超聲時(shí)間和液料比對(duì)PfP 提取率交互影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.7 Response and contour plot of synergetic effect of ultrasonic time and liquid/solid on the extraction rate of PfP

比較3 組圖中的響應(yīng)曲面圖可知：液料比（X2）對(duì)PfP 提取率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；而超聲時(shí)間（X3）與超聲溫度（X1）對(duì) PfP 提取率的影響次之，表現(xiàn)為曲線較為平滑。比較3 組圖中的等高線圖可知：X1X2、X2X3交互作用顯著（等高線為橢圓形），X1X3交互作用不顯著（等高線為圓形）。

通過(guò)Design Expert 8.0 軟件分析得到的PfP 超聲提取最優(yōu)工藝條件為：超聲時(shí)間26.67 min、超聲溫度65.56 ℃、液料比 28.96 ∶1（mL/g），最佳提取率預(yù)測(cè)值為14.54%。為了驗(yàn)證試驗(yàn)方案的有效性，并考慮實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件調(diào)整為：超聲時(shí)間27 min、液料比 29 ∶1（mL/g）、超聲溫度 66 ℃，在此條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)。結(jié)果PfP 提取率平均值為14.69%，與預(yù)測(cè)值相符，偏差較小，表明優(yōu)化結(jié)果可靠，可用于阿魏菇多糖的提取。

2.3 阿魏菇多糖體外抗氧化活性研究

2.3.1 阿魏菇多糖還原能力測(cè)定

阿魏菇多糖對(duì)Fe3+還原能力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 PfP 還原Fe3+的結(jié)果Fig.8 The results of reducing power

由圖8 可以看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，阿魏菇多糖PfP 和對(duì)照品VC的質(zhì)量濃度越大，其吸光值越大，表明對(duì)Fe3+的還原能力越強(qiáng)，還原能力與質(zhì)量濃度的增加呈正相關(guān)性；當(dāng)其質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL 時(shí)，使Fe3+還原產(chǎn)生的吸光度平均值為0.54，盡管比對(duì)照品VC的還原能力弱（A=0.979），對(duì)Fe3+仍顯示出一定的還原能力。

2.3.2 阿魏菇多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力測(cè)定

阿魏菇多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 PfP 對(duì)DPPH 自由基的清除能力Fig.9 The result of clean DPPH radical scavenging activity

由圖9 可以看出，對(duì)照品VC具有極強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，最小試驗(yàn)濃度（0.25 mg/mL）VC的清除率即達(dá)到92.45%；而受試樣品PfP 的質(zhì)量濃度越大，其對(duì)DPPH 自由基的清除能力越強(qiáng)，其清除能力與質(zhì)量濃度的增加呈正相關(guān)性，最大試驗(yàn)濃度組（4.0 mg/mL）PfP 對(duì)DPPH 自由基的清除率可達(dá)85.61%，雖然低于與同濃度對(duì)照品VC的清除率，仍顯示出較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

2.3.3 阿魏菇多糖對(duì)羥自由基（·OH）的清除試驗(yàn)

阿魏菇多糖對(duì)·OH 清除能力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 PfP 對(duì)羥基自由基（·OH）的清除能力Fig.10 The result of clean·OH radical scavenging activity

從圖10 可以看出，對(duì)照品VC具有極強(qiáng)的清除·OH的能力，而受試樣品PfP 的質(zhì)量濃度越大，其對(duì)·OH 的清除能力越強(qiáng)，其清除能力與質(zhì)量濃度的增加呈正相關(guān)性，最大試驗(yàn)濃度組（4.5 mg/mL）PfP 對(duì)·OH 的清除率可達(dá)56.1%，雖然低于與同濃度對(duì)照品VC的清除率，仍顯示出一定的·OH 清除能力。

3 結(jié)論

本文在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用BBD 和RSM 方法對(duì)阿魏菇多糖PfP 的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并利用DPPH 自由基、羥基自由基的清除能力和Fe3+的還原力評(píng)價(jià)其體外抗氧化能力。結(jié)果顯示，所建立的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型擬合程度高，試驗(yàn)誤差小，最佳提取工藝為：液料比為 29 ∶1（mL/g），66 ℃超聲輔助提取27 min，在此條件下PfP 的提取率為14.69%；該工藝條件與文獻(xiàn)報(bào)道的熱水浸提阿魏菇多糖方法相比，節(jié)省大量時(shí)間，且提取溫度較低；該超聲輔助提取工藝條件下阿魏菇多糖提取率也高于已有的文獻(xiàn)報(bào)道[15，25]，對(duì)實(shí)際應(yīng)用操作具有一定的參考價(jià)值。體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，按照最佳提取工藝提取的PfP具有較強(qiáng)的清除DPPH 自由基、羥基自由基的能力和一定的還原能力，具有開(kāi)發(fā)成為天然抗氧化劑而用于功能性食品或藥品的潛能。本文的研究結(jié)果可為阿魏菇多糖在功能性食品、藥品等領(lǐng)域的深入開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)和參考。