李文靜，李紅，倪輝，李利君

（集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門(mén)361021）

茶葉是我國(guó)重要的農(nóng)產(chǎn)品[1-3]，烏龍茶是我國(guó)第3大類(lèi)茶。烏龍茶因具有獨(dú)特的風(fēng)味及防癌、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗肥胖等[4-7]保健功效故深受消費(fèi)者喜愛(ài)。

茶多酚物質(zhì)是茶湯滋味中苦味、澀味的主要呈味成分，也是茶葉中最重要的活性組分。一般說(shuō)來(lái)，兒茶素類(lèi)物質(zhì)是茶葉中最主要的茶多酚[2]，常見(jiàn)的8 種兒茶素是表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒(méi)食子酸兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、兒茶素（catechin，C）、沒(méi)食子酸兒茶素（gallocatechin，GC）、沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）和兒茶素沒(méi)食子酸酯（catechin gallate，CG）[8-9]。Zhao 等[3]在烏龍茶中同時(shí)檢測(cè)到 6 種兒茶素：EGC、C、EGCG、EC、GCG 和ECG，其中 EGC、EGCG、EC 和 ECG 的含量較高。研究表明，這些兒茶素類(lèi)物質(zhì)具有多種生物活性，如中和活性自由基[10]，去除金屬離子催化[11]，調(diào)節(jié)信號(hào)分子[12]，影響凋亡調(diào)控基因的表達(dá)[13]，減輕炎癥[14]，誘導(dǎo)一氧化氮合成酶和環(huán)脫氫酶活性[15]，其中EGCG 被認(rèn)為是兒茶素中活性最強(qiáng)的成分。

由于茶多酚物質(zhì)是形成茶香氣和滋味品質(zhì)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，因此對(duì)茶的香氣和滋味進(jìn)行改良是茶葉加工領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。研究表明纖維素酶類(lèi)、糖苷酶類(lèi)等外源酶對(duì)茶葉中茶多酚成分具有顯著影響，對(duì)于改善茶的品質(zhì)具有重要意義。黑曲霉（Aspergillus niger）是常用的食品酶制劑生產(chǎn)菌株，安全性高，能夠分泌多種胞外蛋白酶組分。Kim 等[16]利用商品化的黑曲霉來(lái)源的纖維素酶處理綠茶渣，結(jié)果表明纖維素酶處理可以顯著提高浸提液中總茶多酚、總兒茶素和還原糖含量。Baik 等[17]采用商品化的黑曲霉來(lái)源的單寧酶和果膠酶處理綠茶葉，發(fā)現(xiàn)提取物中的非酯型兒茶素含量顯著上升，酯型兒茶素如EGCG 含量顯著降低，并且抗氧化活性增強(qiáng)；而果膠酶則通過(guò)水解綠茶多糖，使得提取物中活性多糖的含量顯著提高。

茶多酚的檢測(cè)方法有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis，CE）[18-19]，氫譜的核磁共振法（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）[20]，近紅外光譜法（near infrared spectroscopy，NIRS）[21]，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）[22]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）等。目前應(yīng)用最廣泛的方法仍是高效液相色譜法，但近年來(lái)使用LC-MS[23]或者HPLC-MS/MS[24]測(cè)定兒茶素也成為研究熱點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的定量測(cè)定兒茶素含量。

前期研究發(fā)現(xiàn)從烏龍茶測(cè)定的9 種兒茶素中含有多組差向異構(gòu)體，如 C 和 EC、EGCG 和 GCG、ECG 和CG、GC 和ECG，這些表型和相應(yīng)非表型兒茶素通過(guò)質(zhì)譜圖很難區(qū)分，因此本研究首先對(duì)建立的LC-MS/MS方法進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)液相色譜實(shí)現(xiàn)了差向異構(gòu)體的分離，并使用優(yōu)化后的方法對(duì)烏龍茶中兒茶素的含量變化進(jìn)行分析。隨后，利用優(yōu)化后的檢測(cè)方法，分析了6 種不同培養(yǎng)基發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)生的胞外酶液處理烏龍茶后對(duì)其茶多酚組分變化影響，為直接利用微生物發(fā)酵制備的胞外酶改善茶葉品質(zhì)提供了參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉菌株：購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌株保藏管理中心（CICC）；烏龍茶：市售；沒(méi)食子酸（GA）、沒(méi)食子酸兒茶素（GC）、表沒(méi)食子酸兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）和兒茶素沒(méi)食子酸Z 酯（CG）的純度≥98%（HPLC-DAD 檢測(cè)）：成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）：Sigmaaldrich。福林酚試劑、甲醇、碳酸鈉為國(guó)產(chǎn)分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉發(fā)酵胞外酶粗酶液的制備

分別用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、察氏液體培養(yǎng)基（察氏）、果膠液體培養(yǎng)基（果膠）、麥麩固體培養(yǎng)基（麥麩）、柚皮粉固體培養(yǎng)基（柚皮）以及茶葉梗固體培養(yǎng)基（茶葉梗）發(fā)酵黑曲霉。液體培養(yǎng)基取其發(fā)酵液；固體培養(yǎng)基，待發(fā)酵完成后，麥麩和柚皮粉固體培養(yǎng)基加入pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液，茶葉梗固體培養(yǎng)基加入pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液，20 ℃下180 r/min 振蕩浸提1 h。浸提后抽濾得粗酶液。

1.2.2 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配置

分別稱(chēng)取 GA、CG、EGCG、EGC、EC、GCG、C、GC 和ECG 標(biāo)準(zhǔn)品，用50%乙腈水溶液溶解，配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液。

1.2.3 樣品溶液的配置

1.2.3.1 烏龍茶樣品溶液配制

稱(chēng)取1.000 g 粉碎的烏龍茶，加入40 mL 預(yù)熱的蒸餾水，振蕩搖勻。40 ℃水浴浸提，浸提后沸水浴5 min，再過(guò)濾，洗滌，定容至50 mL。

1.2.3.2 黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶樣品溶液配制

稱(chēng)取1.000 g 粉碎的烏龍茶，加入15 mL 預(yù)熱的黑曲霉胞外酶液和25 mL 預(yù)熱的蒸餾水，振蕩搖勻后如1.2.3.1 的方法制備。對(duì)照組如1.2.3.1 方法所示。

1.2.4 色譜條件的優(yōu)化

初始的色譜條件：流動(dòng)相A（含有0.1%甲酸的超純水溶液）、B（含有0.1%甲酸的乙腈溶液），進(jìn)樣量為5.0 μL，色譜流速 0.5 mL/min，柱溫設(shè)為 25 ℃。洗脫梯度如表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition

1.2.4.1 色譜柱的選擇

按照初始色譜條件，分別使用3 種色譜柱：Spursil C1（8150 × 2.1 mm，3 μm，Agilent）、Zorbax SB-C1（8150 ×4.6 mm，5 μm，Agilent）和 Nucleodur PFP（250 × 4.6 mm，5 μm，Macherey-nagel），比較不同色譜柱的分離度和分析時(shí)間，選擇分離度高而分析時(shí)間短的柱子進(jìn)行下一步優(yōu)化。

1.2.4.2 梯度洗脫的優(yōu)化

色譜條件同1.2.4，使用1.2.4.1 優(yōu)化得到的色譜柱，按照表2 梯度方法優(yōu)化洗脫梯度，比較不同梯度方法的分析時(shí)間，選出優(yōu)化的洗脫梯度。

1.2.4.3 柱溫條件的優(yōu)化

在 1.2.4.2 方法的基礎(chǔ)上，考察溫度為 25、30、35 ℃和40 ℃時(shí)色譜柱的柱溫對(duì)色譜分離度和靈敏度（信噪比）的影響，選擇柱溫條件。

表2 梯度洗脫方法Table 2 Three kinds of gradient elution methods

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 線性關(guān)系測(cè)定

取一定量的各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的儲(chǔ)備液用乙腈水溶液稀釋成一系列濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)。茶葉中各種兒茶素的含量差別較大，因此使用不同的濃度范圍，即GA、GC、ECG 和 CG 的濃度范圍為 40 μg/L～2 000 μg/L，C 和 EC 的濃度范圍為 20 μg/L ～2 000 μg/L，EGC、EGCG 和 GCG 的濃度范圍為 20 μg/L～5 000 μg/L。根據(jù)1.2.3 優(yōu)化的色譜方法，在質(zhì)譜MRM 模式下進(jìn)行分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.5.2 方法精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

通過(guò)日內(nèi)和日間變化來(lái)評(píng)價(jià)定量方法的精密度和準(zhǔn)確度。日內(nèi)變化是在同一天測(cè)定同一個(gè)一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液6 次，計(jì)算含量和誤差。日間變化是連續(xù)3 d 測(cè)定同一個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每日一次，計(jì)算含量和誤差。按照公式（1），測(cè)定含量和理論含量的比值反應(yīng)準(zhǔn)確度，標(biāo)準(zhǔn)偏差反應(yīng)精密度。

1.2.5.3 回收率試驗(yàn)

回收率使用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定，選擇一個(gè)兒茶素含量較低的已知濃度的茶湯樣品，向樣品中添加一定量標(biāo)準(zhǔn)品，然后把加標(biāo)后的樣品按照與樣品相同的處理方法處理后上機(jī)測(cè)定，回收率的計(jì)算見(jiàn)公式（2）。

1.2.6 定性定量分析烏龍茶湯中兒茶素

通過(guò)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息對(duì)樣品中兒茶素進(jìn)行定性。樣品中兒茶素的含量通過(guò)外標(biāo)法測(cè)定。

1.2.7 黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯的總茶多酚含量測(cè)定

總茶多酚含量的測(cè)定參考GBT8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》，以各個(gè)沒(méi)食子酸工作液的吸光度值為y 軸，其相應(yīng)的濃度為x 軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 LC-MS/MS 測(cè)定黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯中兒茶素含量

樣品溶液測(cè)定前用0.22 μm 的有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾，然后稀釋100 倍進(jìn)行LC-MS 分析，LC-MS 的采集方法使用優(yōu)化后的條件，兒茶素的定性和定量分析方法同1.2.6。

1.2.9 感官評(píng)價(jià)黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯的滋味

按照1.2.1 的方法將制得的黑曲霉胞外酶液進(jìn)行純化。稱(chēng)取1.000 g 粉碎的烏龍茶，加入1 mL 預(yù)熱的純酶液和14 mL 預(yù)熱的蒸餾水，振蕩搖勻。對(duì)照組直接加入15 mL 預(yù)熱的蒸餾水，振蕩搖勻。40 ℃水浴浸提60 min，浸提后過(guò)濾，定容至50 mL，待評(píng)價(jià)。

黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯的滋味感官評(píng)價(jià)參考文獻(xiàn)中方法[25]，滋味評(píng)價(jià)指標(biāo)分別是：鮮味、苦味、澀味、甜味和酸味，各項(xiàng)指標(biāo)使用10 分制（9 分= 極強(qiáng)烈，5 分 = 中等強(qiáng)度，0 分 = 極淡）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

在初始色譜條件下，分別對(duì)不同的色譜柱進(jìn)行選擇，并對(duì)洗脫梯度方法以及柱溫條件進(jìn)行優(yōu)化。最優(yōu)條件下分離兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）如圖1 所示，優(yōu)化后的色譜條件為：選用 Nucleodur PFP 色譜柱，進(jìn)樣量 5.0 μL，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，梯度洗脫時(shí)間25 min。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的TIC 圖Fig.1 The TIC of standard catechins

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 定量線性范圍及檢出限

利用一系列濃度的9 種標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限如表3 所示。

由表3 可知，9 條標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性均≥0.998，線性關(guān)系良好。EGC、CG、EGCG 和 GCG 的檢出限和定量限最低，分別是 1 μg/L 和 4 μg/L。GA、GC、EGC、C 和EC的檢出限是 4 μg/L，其中GC、C 和 EC 的定量限是 5μg/L，而 GA 和 EGC 的定量限分別為 10 μg/L 和 25 μg/L。EGC 的檢出限和定量限最高，Zhao 等[3]和 Hu 等[26]的研究中也發(fā)現(xiàn)EGC 比其它兒茶素的定量限高，這可能與EGC 的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、檢出限和定量限Table 3 Linear equation，linear range，correlation coefficient（r），limit of detection and limit of quantification of standard compounds

2.2.2 方法精密度和準(zhǔn)確度

精密度和準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，對(duì)比日內(nèi)和日間的精密度和準(zhǔn)確度，日內(nèi)的精密度和準(zhǔn)確度一般比日間的好。9 種化合物日內(nèi)的精密度≤3.72%，日間的精密度≤5.72%，日內(nèi)的準(zhǔn)確度在99.70%～104.16%之間，日間的準(zhǔn)確度范圍96.17%～106.61%，說(shuō)明方法的精密度和準(zhǔn)確度好，可以滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。

2.2.3 回收率

烏龍茶湯中 GA、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG 和CG 的加標(biāo)回收率見(jiàn)表5。

表4 標(biāo)準(zhǔn)品的精密度和準(zhǔn)確度Table 4 Precision and accuracy of standard catechins

表5 加標(biāo)回收率Table 5 Recovery of standard catechins

由表 5 可知，GA、GC、EGC、C、EC、EGCG 和 ECG的回收率良好，范圍是88.34%～107.52%。GCG 和CG的回收率較低，分別為76.05%和8.23%，造成CG 的回收率極低的原因尚不明確。所有標(biāo)準(zhǔn)品加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤3.59%。

2.3 烏龍茶湯中兒茶素含量測(cè)定

烏龍茶湯MRM 模式下TIC 圖見(jiàn)圖2。如圖2 所示，通過(guò)和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)比，并結(jié)合質(zhì)譜信息，可以確定烏龍茶湯中含有9 種兒茶素：GA、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG 和 CG。

對(duì)烏龍茶湯中兒茶素含量見(jiàn)表6。

表6 烏龍茶湯中兒茶素含量測(cè)定Table 6 The contents of catechins in oolong tea infusion

由表6 可知，烏龍茶湯中占兒茶素總量最多的是EGC 和EGCG，百分比均在30%以上；其次是EC、GC、ECG 和 C，百分比均在 1%以上；而 GA、CGG 和 CG 的含量最低，百分比不足0.5%。

2.4 黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯的茶多酚的含量測(cè)定

圖3 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.3 The standard curve of GA

2.4.1 黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯的茶多酚總量測(cè)定

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見(jiàn)圖3，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為：Y=0.011 6X+0.030 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，線性相關(guān)性良好，說(shuō)明所建立的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線可以滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。

胞外酶浸提烏龍茶湯中的茶多酚總量測(cè)定結(jié)果（已扣除酶液背景干擾）見(jiàn)圖4。

圖4 黑曲霉胞外酶處理烏龍茶湯的茶多酚總量Fig.4 The content of tea polyphenols in the oolong tea infusions extracted by extracellular enzymes

由圖4 可知，烏龍茶提取液中茶多酚總量為1 712 mg/L，PDA 和察氏培養(yǎng)基所得酶液浸提烏龍茶湯中茶多酚總量無(wú)顯著變化，柚皮和茶葉梗培養(yǎng)基所得酶液浸提的烏龍茶湯中茶多酚總量顯著提高，增加量分別為9%和23%。Chandini 等[27]使用單寧酶液溫育紅茶葉，然后加水浸提紅茶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅茶湯的茶多酚總量提高了14.3%。

茶葉中茶多酚包括兒茶素類(lèi)、類(lèi)黃酮類(lèi)和黃烷醇類(lèi)，它是重要的抗氧化劑，而且是茶葉中最主要的醫(yī)療活性成分[28]。因此茶多酚含量的增加，有利于增加茶葉的醫(yī)療價(jià)值。

2.4.2 LC-MS/MS 測(cè)定黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯中兒茶素含量

不同來(lái)源的黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯后對(duì)兒茶素含量的影響變化見(jiàn)表7。

表7 黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯中兒茶素含量Table 7 The contents of catechins in the oolong tea infusions extracted by extracellular enzymes mg/L

由表7 可知，用果膠、麥麩和茶葉梗培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯的總兒茶素含量分別是 1 654.12、1 839.14、1 611.12 mg/L，明顯高于未處理過(guò)的烏龍茶湯（1 537.53 mg/L）。另一方面，使用PDA、察氏和柚皮培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯中總兒茶素含量均有所下降，分別是565.44、1 278.57、1 428.70 mg/L。9 種兒茶素的含量測(cè)定結(jié)果表明（已扣除酶液背景干擾，表7），不同培養(yǎng)基發(fā)酵黑曲霉所得胞外酶液對(duì)烏龍茶湯中兒茶素的含量和組成產(chǎn)生了顯著的影響（p＜0.05）。PDA 培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液使烏龍茶湯中GA 的含量顯著提高，對(duì)ECG 的含量無(wú)顯著影響，但使C 等7 種兒茶素的含量均明顯下降。察氏和柚皮培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液對(duì)烏龍茶中兒茶素的溶出沒(méi)有促進(jìn)作用，9 種兒茶素的含量都沒(méi)有增加。果膠培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液顯著增加了烏龍茶湯中EC、ECG和 EGCG 的含量，對(duì) EGC、C、GA 和 GC 的含量無(wú)顯著性影響，但是GCG 和CG 的含量顯著下降。麥麩培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液對(duì)提高烏龍茶湯中兒茶素含量有明顯的促進(jìn)作用，9 種兒茶素含量都顯著高于未處理茶湯。用茶葉梗培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯中EC、EGC 和GA 的含量顯著增加，而 C、CG、ECG、EGCG、GC 和 GCG 的含量顯著下降。

為了進(jìn)一步的分析不同培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液對(duì)烏龍茶湯中兒茶素含量的影響，將9 種兒茶素分成3 類(lèi)，分別是酯型兒茶素類(lèi)（包括CG、ECG、EGCG、GCG），非酯型兒茶素類(lèi)（C、EC、EGC、GC）和GA。

圖5 黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯中酯型和非酯型兒茶素含量變化Fig.5 The contents of galloylated catechins and non-galloylated catechins in the oolong tea infusions extracted by extracellular enzymes

由圖5 可知，麥麩和果膠培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯中酯型和非酯型兒茶素的含量都明顯提高，而PDA、察氏和柚皮培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯中酯型兒茶素類(lèi)和非酯型兒茶素類(lèi)的含量都有所下降。茶葉梗培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯中酯型兒茶素含量急劇下降，同時(shí)非酯型兒茶素的含量大幅上升。以上結(jié)果說(shuō)明6 種黑曲霉胞外酶液對(duì)烏龍茶湯的兒茶素種類(lèi)和含量都產(chǎn)生了顯著影響。

2.5 感官評(píng)價(jià)黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯的滋味

7 名評(píng)茶員按照苦味、澀味、甜味、鮮味和酸味指標(biāo)分別對(duì)6 種黑曲霉胞外酶液浸提的烏龍茶湯的滋味進(jìn)行評(píng)價(jià)。黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯的滋味感官評(píng)價(jià)見(jiàn)表8。

表8 黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯的滋味感官評(píng)價(jià)表Table 8 Sensory evaluation results of the oolong tea infusions extracted by extracellular enzymes

烏龍茶湯中5 種滋味指標(biāo)的強(qiáng)度順序?yàn)椋嚎辔叮緷叮觉r味＞酸味＞甜味，可見(jiàn)鐵觀音烏龍茶的苦澀味比較明顯。

研究表明非酯型兒茶素閾值比酯型兒茶素高，如EGC 的閾值比 EGCG 高約 2.5 倍[29-30]，所以當(dāng)茶湯中酯型兒茶素含量降低時(shí)可以明顯減輕茶湯的苦味和澀味。

表8 中感官評(píng)價(jià)表明，茶葉梗培養(yǎng)基所得酶液使烏龍的苦味和澀味都明顯降低，這與LC-MS/MS 測(cè)定的茶葉梗培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯中酯型和非酯型兒茶素含量變化結(jié)果一致；用麥麩培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯的澀味顯著增強(qiáng)，這與茶湯中酯型兒茶素的含量增加有關(guān)。圖5表明PDA 培養(yǎng)基所得酶液浸提烏龍茶湯中酯型和非酯型兒茶素含量都明顯降低，因而感官結(jié)果顯示PDA培養(yǎng)基所得酶液使烏龍茶湯的苦味顯著降低。綜上可知，感官評(píng)價(jià)結(jié)果中苦味和澀味的強(qiáng)度變化與烏龍茶湯中酯型兒茶素的含量變化基本一致。此外，茶葉梗培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液處理使得烏龍茶湯的酸味明顯增強(qiáng)，察氏、果膠和柚皮培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液處理對(duì)烏龍茶湯的滋味沒(méi)有顯著影響。鮮味和甜味的方差分析結(jié)果表明6 種培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液對(duì)烏龍茶湯的鮮味和甜味沒(méi)有明顯的改變作用。

3 結(jié)論

本文通過(guò)優(yōu)化后的LC-MS/MS 方法測(cè)定烏龍茶湯中茶多酚組分變化，并對(duì)烏龍茶湯進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，研究了6 種培養(yǎng)基發(fā)酵黑曲霉所得胞外酶液對(duì)烏龍茶湯中茶多酚的影響。優(yōu)化后的LC-MS/MS 方法相比UHPLC-UV[31]以及NIRS[32]等方法更為簡(jiǎn)單且分離度高，分離時(shí)間更短。黑曲霉是酶制劑生產(chǎn)菌株，根據(jù)不同的誘導(dǎo)基質(zhì)能夠分泌不同的胞外蛋白酶組分。用6 種不同的基質(zhì)誘導(dǎo)黑曲霉發(fā)酵，對(duì)茶多酚的組分變化產(chǎn)生了不同的影響。結(jié)果表明，茶葉梗培養(yǎng)基所得酶液浸提的烏龍茶湯中茶多酚總量顯著提高，同時(shí)烏龍茶湯中非酯型兒茶素的含量也大幅提高，而酯型兒茶素含量有所降低。果膠、麥麩培養(yǎng)基所得酶液浸提烏龍茶湯的總兒茶素明顯高于參考烏龍茶湯，烏龍茶湯中酯型和非酯型兒茶素的含量也有所提高。PDA、察氏、柚皮培養(yǎng)基所得酶液浸提的烏龍茶湯中不僅總兒茶素含量降低，并且酯型兒茶素類(lèi)和非酯型兒茶素類(lèi)的含量也降低。

不同培養(yǎng)基發(fā)酵引起茶多酚的組分變化，進(jìn)而影響其風(fēng)味。感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，6 種黑曲霉胞外酶液對(duì)烏龍茶湯的鮮味和甜味無(wú)顯著性影響。PDA 和茶葉梗培養(yǎng)基所得酶液使烏龍茶湯的苦澀味明顯降低，麥麩培養(yǎng)基所得酶液浸提的烏龍茶湯中澀味顯著增強(qiáng)，這與烏龍茶湯中酯型兒茶素的含量變化有關(guān)。