Michael O Fagbohungbe , Ben M J Herbert , Lois Hurst , Hong Li , Shams Q Usmani , Kirk T Semple

(1.Lancaster Environment Centre, Lancaster University, Lancaster LA1 4YQ, United Kingdom; 2. Stopford Energy and Environment, Merseyton Road, Ellemere Port, Chester CH65 3AD, United Kingdom; 3. Ariva Technology, The Heath Business and Technical Park, Runcorn, Cheshire WA7 4EB, United Kingdom)

1 柑橘皮廢料處理工藝現狀

柑橘皮廢料是一種含有纖維素和香精油的木質纖維材料，其中32%～98%的成分是由烷基芳烴合成的檸檬烯。檸檬烯是一種無色液體，有刺激性氣味，其沸點是176℃，屬于環(huán)萜烯。厭氧消化(AD)的研究表明柑橘皮在有機負荷為2～3.5 g-1VS·d-1時可以抑制生物活性。但是，最近有研究表明，柑橘皮與其他材料或高溫厭氧發(fā)酵下聯合厭氧消化更穩(wěn)定，抑制作用更弱。盡管聯合厭氧消化提供了一種經濟手段使與某些個別底物有關的難度最小化，但是也要考慮共基質的可用性和可及性。同樣地，因為高溫發(fā)酵的成本相對較高，高溫發(fā)酵(>55℃)很少被用到。其他的一些方法也已被探索出來，比如微生物的馴化、在AD進程前或者期間去除有毒化學物質。目前，在AD期間抗檸檬烯毒性的方法主要是降低濃度、增加細菌的馴化時間。但是，降低檸檬烯濃度更可取的方法是用物理方法去除AD系統(tǒng)中的檸檬酸，因為同化產生的代謝物具有抑制作用。蒸汽蒸餾現已被證實是一種能從柑橘皮廢料中去除多達70%的檸檬烯的方法，但它的能源消耗也很大。除了蒸汽蒸餾和溶劑萃取，吸附被認為是一種去除有機物的方法。例如，Chen et al報道了吸附劑對減少潛在的抑制劑有積極作用，如氨和長鏈脂肪酸。像沸石、活性炭、膨潤土、硅膠這些吸附劑已被報道出可將AD過程中的有毒化學物質除去。雖然生物炭在AD中去除潛在的抑制化學物質的應用還未得到充分的研究，但是有跡象表明生物炭可以吸附單萜化合物。

生物炭是由植物衍生生物質在局部或完全無氧環(huán)境中進行熱處理產生的。熱處理通過改變粒子的顯微結構來形成一個芳香-脂肪區(qū)和一個結晶區(qū)，它們由不同內徑(ID)的孔隙組成。微孔(ID<2 nm)、大孔(ID>50 nm)、中孔(2 nm

2 材料與方法

2.1 底物與接種

此研究以柑橘皮廢料為底物，以消化污泥為微生物接種源。消化污泥由污水處理廠(United Utilities, Preston, UK)提供。對消化污泥進行表征，其所含總固體量為11.0%±0.13%，揮發(fā)性固體量為52.1%±0.36%，SCOD含量為27.0±0.23 g·L-1，NH4-N含量為0.71±0.17 g·L-1，pH值為7.26±0.02。柑橘來自英國蘭開斯特當地的一家知名超市。清洗后進行榨汁，并稱量果皮和果肉重量。柑橘皮廢料與32 g檸檬，12 g石灰，53 g橙子，30 g橘子和65 g葡萄皮混合，攪拌均勻并冷凍保存?；旌媳壤鶕磕戤a生的不同柑橘廢料的平均數量來選擇(FAOSTAT, 2013)。

文中使用了木材生物表(WB)，椰殼生物炭(CSB)和稻殼生物炭(RHB)。這些生物炭的制作是在450℃下熱解形成。CSB和RHB取自馬來西亞，WB取自英國。這些生物炭粒徑為1.7～2.0 mm。

2.2 實驗設計與步驟

柑橘皮廢料AD批次實驗的研究主要是：1)柑橘皮和生物炭類型； 2)柑橘皮和生物炭比例?？刂婆囵B(yǎng)只包括接種、柑橘皮、接種。本研究使用一個500 mL杜蘭瓶，帶有修改過的橡膠塞，塞上有氣體和液體的取樣口，氣體端口連接一個檢測器用于氣體體積的測量。在測定甲烷之前，沼氣通過一個含有3 mol·L-1NaOH的100 mL杜蘭瓶使CO2固定。此外，橡膠塞上還有一個攪拌棒端口，可允許12 V DC電動機在30 rpm下進行機械均化。厭氧反應器在35℃數字水浴鍋中培養(yǎng)30 d。根據揮發(fā)性固體含量，底物與接種物之比在0.31～0.33之間。由于第一項研究目的是不同類型生物炭的影響，不同的生物炭材料根據總固體干重與柑橘皮以1∶1混合，WB根據總固體干重，柑橘皮和生物炭比例分別為1∶3，1∶2，1∶1。試驗方案總結如表1，在500 mL的杜蘭瓶內裝300 mL的接種物，將其放在35℃的環(huán)境下培養(yǎng)2 d，可以顯著的減少有機物含量。之后將各組分與底物混合，開始試驗。用3 mol·L-1NaOH調節(jié)各反應物的pH值大約為7，然后用氮氣凈化系統(tǒng)1 min去除多余的O2。最后，用1 mm的篩子將沼渣從生物炭中分離出來進一步分析。

2.3 化學分析

通過將樣品在105℃的烘箱(Memmert, Germany)和550℃的馬弗爐(Carbonite, Sheffield UK)中加熱24 h來分析TS和VS含量。分別用于TS和VS的測定(APHA,1998)。測量pH值后，將樣品在4500 rpm下離心15 min，上清液用0.45 μm的醋酸纖維素膜過濾，得到可溶性部分。用含有重鉻酸鹽和二元醇的消化試劑盒測定可溶性組分中SCOD和TFVA，此方法在簡單消化后，用定量Hach分光光度法(DR/2800)測定顏色變化。為了測定元素和木質纖維素，需將樣品用60℃的烘箱烘干。用元素分析儀將球磨干樣進行碳、氮、氫、硫、氧元素的測定。用回流裝置和纖維洗潔精進行樣品中纖維素、半纖維素和木質素含量的分析;用重量法(ANKOM, USA)測定木質纖維素的組成;復合分離需用超2毛細管柱熱解吸GC-MS法測定檸檬烯濃度。先在35℃烘箱中放置2 min，在4℃·min-1時加熱至160℃，然后在45 min時加熱至300℃，保持10 min。沖洗時，用10 μL注射器吸取5 μL樣品，注入吸附樹脂、Tenax TA和Carbotrap中，并持續(xù)用氣吹掃。

表1 柑橘皮發(fā)酵、柑橘皮和不同類型生物炭混合發(fā)酵的批次實驗條件 (g)

2.3.1 陽離子交換容量(CEC)

此分析用1M鈉溶液和醋酸鋁來測定生物炭的控制和交換能力(Huff etal, 2014)。將乙酸鈉和乙酸鋁的pH值分別調整至8.2和7，將乙酸鈉溶液裝入含有4 g生物炭的燒瓶內，置換生物炭表面存在的其他陽離子。經過10 min 500 rpm的離心(Rotana Zentrifugen)后，去掉上清液。此時，生物炭殘渣的負極區(qū)域覆蓋有大量的鈉離子。然后將乙酸銨溶液加入生物炭中置換鈉離子，將混合物離心，除去上清液，用火焰光度計(JenWay, UK)測量鈉離子的位移量。置換鈉離子的濃度與生物炭材料的陽離子交換能力成正比。

2.3.2 實際甲烷生產

用帶有電子脈沖傳感器和數據記錄裝置的校準提示計對甲烷的產量進行量化。實際甲烷產量是由減去純接種物的培養(yǎng)液的甲烷產量決定的，盡管在僅有接種物發(fā)酵時未觀察到可測量的甲烷?？偧淄楫a量是由生成甲烷的體積除(ACH4)以初始揮發(fā)性固體總量(gVS)決定的。

(1)

式中：ACH4為實際甲烷體積；VS為添加的柑橘皮揮發(fā)性固體含量。

2.3.3 理論甲烷生產

理論甲烷產量由公式(2)計算得到，用柑橘皮樣品中分子式的元素組成，即CaHbOcNdSe。理論甲烷用mL·g-1VS表示。

(2)

2.3.3.1 甲烷轉化效率

甲烷轉化效率定義為實際甲烷與理論甲烷之比，如公式(3)所示:

(3)

2.3.4 修改Gompertz方程

檢查所有培養(yǎng)箱的甲烷產量是否符合修改后的Gompertz方程(Zwietering etal, 1990)，甲烷產量是細菌生長函數的假設是修改后的Gompertz方程的應用的基礎(Zhu etal, 2009)。此模型已應用于確定分批生長中的滯后或者適應階段(Syaichurrozi)。Gompertz方程如公式(4):

(4)

式中：F為累積甲烷產量，mL·g-1VS；A為潛在甲烷產量，mL·g-1VS；r為最大甲烷產量速率，mL·g-1VS·d-1；e為常數，2.718282；λ為滯后期的持續(xù)時間；t為累積甲烷產量的時間，d。

2.3.5 數據分析

用Microsoft Excel 2013進行均值、標準差、標準誤差的計算，用Sigma plot軟件13.0版本用于數據統(tǒng)計分析，經過Shapiro-Wilk正常測試后評定在生物炭類型和其比例之間日常甲烷產量的重要性，Holm-Sidak法用來各組之間平均值的多重比較。顯著性檢驗設定p<0.05。

3 結論與討論

3.1 不同生物炭對柑橘皮厭氧消化的影響

第1項研究是有關于在30 d的發(fā)酵周期下3種不同類型生物炭對柑橘皮厭氧消化的表現。甲烷量在培養(yǎng)第1天就迅速出現，在第1天，WB培養(yǎng)出現最高甲烷產量，對此，CSB和RHB培養(yǎng)具有顯著性(p<0.05)，因此，需要為代謝中間產物的有機質分解創(chuàng)造一定的條件。但是，1 d之后所有培養(yǎng)下的甲烷生產都趨于穩(wěn)定到培養(yǎng)3 d后，之后無可測量的甲烷產量。第3天培養(yǎng)的甲烷生產的停滯歸因于柑橘皮有機基質中的檸檬烯的存在。已報道出檸檬烯可嚴重抑制厭氧消化過程和甲烷生成。在第8天的培養(yǎng)中，CSB和WB培養(yǎng)的甲烷產量增加，CSB和WB培養(yǎng)較快的恢復速率表明它們更易吸收檸檬烯。另一方面，RHB培養(yǎng)一直保持抑制狀態(tài)，直到第13天，然后甲烷產量增加，但是，在培養(yǎng)的第17天觀察到甲烷產量顯著增加(p<0.05)。RHB培養(yǎng)的甲烷產量最高，此后觀察到其甲烷產量速率的連續(xù)峰和增加，而CSB和WB培養(yǎng)的甲烷產量持續(xù)下降。CSB和WB培養(yǎng)的甲烷產量下降說明可用有機基質已被新陳代謝。Li等報道出活性炭可以吸收可溶性代謝物，例如乙酸，還有可能吸收氫離子，并且生物炭和活性炭在結構上相似。正如預期的一樣，只有柑橘皮的培養(yǎng)有最長的抑制期，可持續(xù)14 d，這進一步說明生物炭的增加可以提高與柑橘皮一起培養(yǎng)的厭氧菌的恢復速率。這個趨勢類似于Watanabe 等得到的結果，他提到粗甘油的厭氧消化中，日本雪松木炭的添加會有更高的甲烷生產活性水平，這是由于檸檬烯對生物炭的吸附作用。此外，Mumme等發(fā)現，在厭氧消化系統(tǒng)中生物炭的增加可以減少微生物的滯后期從而加快生長期的開始。但是，柑橘皮厭氧消化中不同類型生物炭的內含物在處理過和未經處理過的生物炭中的總甲烷產量都沒有明顯增加(p>0.05)。CSB，WB，RHB和柑橘皮培養(yǎng)的累計甲烷產量分別在第9天，23天，20天完成，同樣地，Mumme等在氨培養(yǎng)的緩解研究中檢測到改性生物炭有更高的累計甲烷產量。從柑橘中獲得的甲烷產量與Serrano等的結果相似，他記錄了在每0.4～1.6 gVS·L-1d-1的OLR是165 mL·g-1VS。高甲烷轉換率表明這個厭氧消化過程是有效的，因此CSB培養(yǎng)的生物炭類型是最有效的處理。

3.2 不同生物炭比例對柑橘皮厭氧消化的影響

第2項研究是觀察柑橘皮厭氧消化中不同生物炭比例在查過30 d培養(yǎng)周期下的表現。此研究用四種不同柑橘皮與WB的混合比例，即1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，測定他們的速率和累計甲烷產量。累計甲烷產量在第1天培養(yǎng)時迅速開始，2∶1的培養(yǎng)有最低甲烷產量速率(p>0.05)。但是，培養(yǎng)3 d后，除了1∶3培養(yǎng)外，其它培養(yǎng)的甲烷產量達到一個無法測量的速率的平衡，平均值在2.69±1.09 mLCH4·g-1VS·d-1，在第9天時增加到7.37±3.01 mLCH4·g-1VS·d-1。如前面提到的，柑橘皮中檸檬烯的含量被認為具有明顯抑制甲烷生成和減少甲烷產量的作用，結果表明，甲烷生成的抑制作用隨柑橘皮和WB的比例的降低而減弱，1∶3，1∶2，1∶1培養(yǎng)分別抑制1 d，2 d，3 d，而2∶1培養(yǎng)會抑制5 d，這支持了WB減少檸檬烯生物活性的觀點，這個趨勢與吸附劑濃度增加對山梨酸鹽的去除有積極作用的結果一致。在只有柑橘皮培養(yǎng)中的抑制率可持續(xù)7 d，含有WB培養(yǎng)的為1～5 d，而且相對于只有柑橘皮培養(yǎng)的總甲烷產量時間即20 d，WB的增加會減少其總甲烷產量時間，平均為17 d。生物炭被認為是可以提供一個大的比表面積，可以讓微生物細胞增殖。據報道，微生物細胞可減小共生細菌和產甲烷菌的距離，這增加了揮發(fā)性脂肪酸的氧化量以及產氫量。但是，WB比例的增加并沒有增加測試培養(yǎng)的總甲烷產量，因為它并沒有明顯放的變化(p>0.05)。因此，我們可以得出結論，即生物炭的增加提高了柑橘皮厭氧消化中的甲烷回收率。但是比較不同生物炭和不同比例的效果時這個參數不能作為一個很好的參考，這是因為它們的總甲烷產量相對來說是相似的。

3.3 動力學因素

甲烷產量的程度與產甲烷種群的增長有直接的關系。修改的Gompertz方程擬合了累積甲烷生產曲線和獲得的參數值(見表2)。得到的回歸≥0.990。修改的Gompertz方程擬合了柑橘皮曲線，如圖1～圖2所示是柑橘皮生物炭類型和比例，數據表明生物炭的增加導致滯后期長度發(fā)生變化，它與生物炭的吸附特性和檸檬烯生物活性的降低有關，從而提高了微生物細胞的回收率。檸檬烯和生物炭具有疏水性，所以范德華力將芳香烴吸附到炭質吸附劑上。RHB培養(yǎng)從第3天～13天的長滯后期和不可測量的甲烷產量速率說明了檸檬烯的抑制作用。

A-CSB和柑橘皮混合發(fā)酵實驗；A′-CSB和柑橘皮混合發(fā)酵模型；B-WB和柑橘皮混合發(fā)酵實驗；B′- CSB和柑橘皮混合發(fā)酵模型；C-RHB和柑橘皮混合發(fā)酵模型；C′ -RHB和柑橘皮混合發(fā)酵模型；D-僅柑橘皮混合發(fā)酵實驗；D′-僅柑橘皮混合發(fā)酵模型。圖1 不同發(fā)酵原料的累計甲烷產量

E-WB和柑橘皮1∶3實驗； E′-WB和柑橘皮1∶3模型； F-WB和柑橘皮1∶2實驗； F′-WB和柑橘皮1∶2模型； G-WB和柑橘皮1∶1實驗； G′-WB和柑橘皮1∶1模型； H-WB和柑橘皮2∶1實驗； H′-WB和柑橘皮2∶1模型.圖2 不同發(fā)酵原料的累計甲烷產量

3.4 檸檬烯去除效率

RHB有最高的去除率，為88.82%，高于其它生物炭材料。生物炭比例方面，檸檬烯的剩余量會隨著生物炭在每個培養(yǎng)中的增加而減少，1∶3培養(yǎng)有最高的去除率，為95.12% ，高于其它培養(yǎng)。檸檬烯濃度的降低與吸附到生物炭上以及生物降解有關，還有可能是因為消化污泥的加入導致其稀釋。只有柑橘皮的控制培養(yǎng)記錄了比較生物炭比例時檸檬烯殘渣的第二低濃度和比較生物炭類型時的最高濃度，含柑橘皮培養(yǎng)的值是10.48 mg·L-1，去除率是93.86% ，由于沒有生物炭材料的添加，預計控制培養(yǎng)會有最高的檸檬烯殘渣濃度，此現象只能歸因于檸檬烯的生物降解。有跡象表明，檸檬烯化合物在AD期間可以被轉換成其它代謝產物。柑橘皮培養(yǎng)有最低甲烷產量和最長滯后期，說明檸檬烯或假定代謝物抑制甲烷生成

表2 擬合累積甲烷生產曲線的參數值

3.5 生物炭的形態(tài)變化

用掃描電鏡法對消化污泥和柑橘皮廢料接種前后不同生物炭的微生物形態(tài)作比較。研究表明，SEM圖像顯示生物炭材料上有微生物的存在，除了CSB外，微生物成功的移植在生物炭上，生物炭表面的整體粒度為微生物細胞或者可能是生物膜提供了有利的環(huán)境。WB上的形態(tài)數量和多樣性最大，這可能是由于材料表面有豐富的大孔隙，但是需要更詳細的生化和分子生物測試去證實這一定論。奇怪的是，CSB培養(yǎng)未表現出明顯的微生物細胞附著，可能是細胞在樣品準備時被清除。生物炭上群體的出現表明是微生物細胞的固定化作用，支持產甲烷菌生成。

4 結論

十分明確在污染土壤和沉積物只加入炭黑，包括生物炭可以減少有毒化學物質的移動性和生物活性。據作者所知，生物炭對厭氧消化和甲烷生成的影響還未被報道。本研究首次探討了生物炭對厭氧消化中檸檬烯的甲烷生產的影響，研究表明，在比較不同生物炭對柑橘皮厭氧消化的影響時，WB培養(yǎng)有最短滯后期，而CSB培養(yǎng)有最高甲烷產量。研究還表明柑橘皮與生物炭比例的增加會延長微生物的滯后期，這說明WB和CSB材料在較高比例時對維持厭氧消化進程的穩(wěn)定性是有效的，尤其是在底物誘導抑制期。

(農業(yè)部沼氣科學研究所 張冀川 譯自：Impact of biochar on the anaerobic digestion of citrus peel waste[J].Bioresource Technology, 2016,(216):142-149)