陳宣, 云勇, 吳宇佳, 戚華沙, 楊立榮, 陳加利, 鄭道君*

海南島油茶種質資源遺傳多樣性的SRAP分析

陳宣1, 云勇1, 吳宇佳2, 戚華沙1, 楊立榮1, 陳加利1, 鄭道君1*

(1. 海南省農業(yè)科學院熱帶園藝研究所, 海南省熱帶特種經濟植物種質資源創(chuàng)新利用重點實驗室，?？?571100; 2. 海南省農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境與土壤研究所, ?？?571100)

為了解海南島油茶()種質資源的遺傳多樣性，采用SRAP分子標記，對海南島油茶主要分布區(qū)的31個居群進行了遺傳多樣性和親緣關系分析。結果表明，海南島油茶資源的遺傳多樣性低，物種水平的多態(tài)性百分率(PPB)為98.30%，Nei’s基因多樣性()為0.222 8，Shannon信息指數()為0.353 8；居群水平的PPB=40.96%, 觀測等位基因數(N)為1.409 6, 有效等位基因數(N)為1.237 1,=0.138 5,=0.208 3，這與海南島油茶豐富的表型多樣性水平不一致。海南島油茶資源遺傳分化較大，居群間基因交流有限，不同居群間的遺傳分化指數(G)為0.380，基因流(N)為0.813 9<1。遺傳變異主要發(fā)生在居群內，有38.05%的變異存在居群間，61.95%存在于居群內。遺傳距離為0.022 6~0.276 4，平均為0.107 7，居群間的親緣關系較近。UPGMA聚類分析表明，在遺傳距離為0.11處，可將31個油茶居群聚為6類，表現出明顯的行政區(qū)域性，而與地理距離關系不大。因此，海南島油茶資源遺傳多樣性低，親緣關系近可能導致自交或近交不親和，可能是海南油茶林分花量大而結實低的主要內在原因。

油茶；SRAP標記；遺傳多樣性；居群；海南島

油茶主要是指山茶科(Theaceae)山茶屬()植物中油脂含量較高且具有栽培經濟價值的一類植物的總稱，是我國重要的木本食用油料樹種。油茶在海南俗稱“山柚”。海南島為中國油茶資源分布的最南緣，各地均有野生種和栽培種，具有種植和利用油茶的悠久歷史[1]。海南島氣候獨特，海峽隔離，油茶又是異花授粉植物，在環(huán)境和遺傳控制的雙重作用下，海南島油茶資源表型變異極為豐富且獨特[2-4]。據海南省林業(yè)局統(tǒng)計，2015年底，全省油茶種植面積達到4 100 hm2，主要分布在瓊海、屯昌、澄邁、五指山、瓊中、定安、?？诘仁锌h，2015年茶籽產量486.3 t，山柚油產量超過80 t，約占全國產量的0.1%。至2018年底，海南省已認定油茶優(yōu)良品種20個，但尚未建立規(guī)范的良種采穗圃。海南島具有豐富而獨特的油茶資源、良好的水熱條件和產業(yè)發(fā)展勢頭，近年來海南島油茶資源的研究與開發(fā)利用受到普遍關注，急需對海南島油茶資源開展科學系統(tǒng)評價。

植物種質資源鑒定與評價是資源有效保護與創(chuàng)新利用的前提。分子標記技術不受季節(jié)和環(huán)境的限制，穩(wěn)定性高，并且分子標記數量極多，遍及整個基因組，多態(tài)性高，是植物資源鑒定與評價的重要手段。其中，RAPD、ISSR和AFLP標記技術已成功應用于油茶資源的遺傳多樣性評價[5-7]、品種鑒定與分類[8-10]、以及抗病性、果油率和產油量與分子標記的相關性[11]，為油茶育種親本的選配和品種鑒定提供科學理論依據。相關序列擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)技術是利用特定引物對ORFs區(qū)域(open reading frames)進行擴增，具有易于操作、花費少、多態(tài)性強及標記分布均勻等特點[12]，已廣泛應用于植物遺傳多樣性研究[13-14]。前人[15-17]應用SRAP標記技術分別對四川省名邛臺地油茶資源、全國19個居群的小果油茶資源和廣東省廣寧紅花油茶種質資源進行了遺傳多樣性評價。

本課題組前期研究表明，海南油茶資源具有豐富的表型多樣性，這是否是其豐富遺傳多樣性的體現？群體間的遺傳結構和親緣關系是怎樣的模式？在悠久的引種與栽培過程中基因流是否通暢？本研究利用SRAP分子標記技術，對海南島主要油茶分布區(qū)的代表性種質資源進行遺傳多樣性分析，探討其遺傳分化和親緣關系，為海南油茶分子標記輔助育種，充分挖掘海南油茶優(yōu)良種質資源和研究其引種栽培歷史提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料來自海南省?？凇⒍ò?、文昌、瓊海、澄邁、屯昌、瓊中、五指山和臨高等9個市縣27個鄉(xiāng)鎮(zhèn)(國營農場)的31個油茶居群，基本涵蓋了海南省的主要油茶分布區(qū)。居群信息見表1。

1.2 方法

總DNA的提取 采用彭邵鋒[8]的改良CTAB法。

SRAP-PCR擴增 反應在IcyclerTMThermal Cycler型PCR儀上進行。SRAP-PCR反應條件和反應程序按鄭道君等[13]的方法，引物由上海英駿生物技術有限公司合成，每個引物對供試材料重復擴增2次。取10L擴增產物，采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測SRAP-PCR的產物，GoodView核酸染色, 在Gel Doc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)下照相并記錄。以3S 100 bp DNA ladder作為對照分子量標準。

1.3 數據的統(tǒng)計分析

根據marker確定PCR條帶分子量，選擇清晰的擴增譜帶用0-1二元矩陣表示，然后統(tǒng)計分析多態(tài)性條帶百分率(PPB)=多態(tài)位點數/位點總數。將0-1矩陣在NTSYSpc (2.1版)軟件中處理, 應用SIMQUAL法計算Jaccard遺傳相似性系數(genetic similarity, GS)，GS=2N/(N+N)，式中,N指兩個個體共有的帶數，N+N指兩個個體所有帶數之和。采用SAHN程序和UPGMA (unweighted pair group mean average)方法進行聚類分析，通過Tree plot模塊構建聚類圖。應用POPGENE 1.31軟件在假定種群處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)下進行遺傳參數分析, 分別計算觀測等位基因數(observed number of alleles,N)、有效等位基因數(effective number of alleles,N)、Nei’s基因多樣性指數(Nei’s gene diversity,)、Shannon’s信息指數(Shannon’s infor- mation index,)，并對不同居群間的遺傳分化系數(G)和基因流進行分析。為了明確這些多樣性指數在各居群間的變異程度，對所有居群的各參數進行變異系數(, %)分析。

表1 海南油茶居群

續(xù)表(Continued)

2 結果和分析

2.1 SRAP-PCR擴增多態(tài)性

選取油茶來源地域及形態(tài)不同的5份種質材料，對經退火溫度初選的100對SRAP引物進行篩選，共選出9對有效引物，然后分別對31個居群材料進行SRAP-PCR擴增，共擴增出122條清晰的譜帶，每對引物平均擴增13.56條，其中多態(tài)性條帶120條，擴增的多態(tài)性條帶百分率(PPB)高達98.30% (表2)，多數條帶為200~2 500 bp。每對引物對不同材料擴增的SRAP-PCR產物有一定差異,反映出不同地域與不同居群的種質材料之間存在遺傳多樣性以及不同程度的親緣關系。

表2 9對SRAP引物對31個海南油茶居群種質的擴增

2.2 遺傳多樣性分析

根據SRAP-PCR譜帶統(tǒng)計結果，利用PopGene軟件分析31個居群的遺傳多樣性(表3)。在物種水平上，PPB為98.30%，N為1.975 4，N為1.352 8，為0.222 8，為0.353 8，可見海南島油茶資源具有較高的遺傳多樣性水平。但是，在居群水平上的遺傳變異卻比較低，PPB為13.93%~59.84%，平均40.96%；N為1.139 3~1.598 4，平均1.409；N為1.083 4~1.357 9，平均1.237；為0.14 8~0.307 7, 平均0.208 3；為0.107 7~0.193 5，平均0.138 5。31個居群間的遺傳多樣性差異較明顯，、和PPB的變異系數()分別為23.82%、23.67%和24.26%, 其中sjgx居群的遺傳多樣性水平最低，zxlw居群的遺傳多樣性水平最高。

表3 海南島油茶居群的遺傳多樣性指數

2.3 居群的遺傳結構和遺傳變異分析

對31個居群進行基因分化分析，計算不同居群間的遺傳分化系數(G)，結果表明，居群總的遺傳多樣性(H)為0.223 6±0.028 2，居群內的基因多樣性(H)為0.138 5±0.010 3，基因流(N)僅為0.813 9<1，表明海南島油茶遺傳多樣性水平較低，G為0.380 5,可見居群間具有較大的遺傳分化，同時也表明有38.05%的遺傳變異存在居群間，而61.95%的遺傳變異存在于居群內，其遺傳變異以居群內變異為主。

2.4 聚類分析

根據SRAP擴增條帶分析結果，采用UPGMA法對31個不同居群進行聚類分析(圖1)。不同居群間的遺傳距離為0.022 6~0.276 4，平均遺傳距離為0.107 7。其中l(wèi)kfh與lkly遺傳關系最近，遺傳距離僅0.022 6，均來自定安嶺口鎮(zhèn)；sjgx與tnlf雖然地理距離不遠，但遺傳距離卻最遠，為0.276 4。在遺傳距離為0.11處，可將31個居群明顯聚為6類,其中類群A由來自瓊海的所有居群sbwl、yjmp、hszj、lj、zyxc和海口的部分居群jzcc、ssjx、yxrz、sjqm組成；B類群包括澄邁的所有居群sfbl、wral、zxlw、jllm，臨高的所有居群htww、hsct、nbgj和定安的所有居群lkfh和lkly；C類群由瓊中的所有居群wlby、czxz、nknl，屯昌的hlsy，以及五指山的cthw和csfs組成；D類群僅由文昌的2個居群jslj和tnlf組成；E類包括五指山的smxc和?？诘膉zbs; F類是?？诘膕jgx和hq。除了來自?？诘木尤汉臀逯干骄尤翰荒芨髯跃蹫橐活愅猓渌锌h來源的居群均按行政區(qū)域聚為一類，表現出明顯的區(qū)域性。

圖1 31個海南油茶居群間的聚類分析圖

3 討論

3.1 海南島油茶資源的遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種長期生存和保持進化的基礎，同時也植物良種培育的遺傳物質基礎。PPB、、作為評價種群內和種群間遺傳多樣性的指標, 其數值越大，表明種群的遺傳多樣性越高[18]。SRAP、RAPD和ISSR一樣，均為顯性標記，研究結果具有可比性。Nybom[19]統(tǒng)計認為植物的平均為0.22 (基于RAPD和ISSR的平均值)，其中37種多年生植物的為0.25。比較而言，海南油茶資源物種水平上的值(0.222 8)僅與上述物種的平均值相近，而居群水平的平均H僅為0.138 5 (0.048 6~0.207)。此外，黃勇等[16]利用SRAP分子標記對貴州、湖南、江西等8個小果油茶分布區(qū)19個居群進行遺傳多樣性分析，認為小果油茶具有豐富的遺傳多樣性, 19個居群的、、PPB分別為0.321 3~0.388 7、0.473 2~ 0.567 6和84.96%~95.58%；物種水平的、、PPB分別為0.422 3、0.612 6和100%。謝薈等[17]利用SRAP分子標記建立了廣東省廣寧紅花油茶()種質資源4個種群的遺傳多樣性評價體系,結果表明，種群的、、PPB分別為0.217 9~0.356 3、0.321 7~0.524 8和58.25%~92.72%，平均值分別為0.307 8、0.456 3和83.62%。張婷等[20]采用SRAP標記對湖北省油茶5個居群的遺傳多樣性進行了研究，結果表明，居群的平均N、、分別為1.516 1、0.274 8和0.389 9。因此，本研究中海南島油茶資源表現出較低的遺傳多樣性水平，物種水平的和僅分別為0.222 8和0.353 8；居群的遺傳變異較物種水平更低，和僅為0.048 6~0.207和0.073~ 0.288 3，這與海南油茶在表型方面豐富的多樣性水平不一致。楊立榮等[21]對海南島21個老油茶林果實和種子的10個數量性狀指標進行了分析，結果表明海南油茶種實表型多樣性十分豐富, 10個種實數量性狀的變異系數()為7.87%~52.93%，平均變異系數為29.36%，變異程度均高于小果油茶()、浙江紅花油茶()、滇西騰沖紅花油茶()、廣東省的廣寧紅花油茶和越南油茶()；平均Shannon- Wiener多樣性指數為2.749 9，接近或大于小果油茶(主要分布于7個省份)?？梢?，海南油茶低水平的遺傳變異不能解析豐富的表型變異。

油茶組是山茶屬中多倍體出現頻率較高的類群，有2、3、4、5、6、7和8，且核型分析存在多樣性，其中奇數多倍體為栽培品種，包括油茶()、小果油茶、越南油茶和攸縣油茶()均是多倍體[22-24]，這些物種除小果油茶外其余物種均存在種內多倍性現象，如越南油茶核型2=120=86m+26sm+8st+2sat[25], 或2=105=61m+37sm+7st+2sat，或2=120=86m+26sm+8st+ 2sat[26]；普通油茶核型為2=30=24m+4sm+2st+ 2sat, 或2=90=60m+29sm+1st+3sat，或2=90= 60m+22sm+8s[27]。倍性變異會影響個體、花朵和果實大小等農藝性狀[28]。海南油茶的核型多樣性是否豐富？是否在海南島油茶資源豐富的表型多樣性過程中扮演重要角色？從本文中海南島油茶資源較低水平的遺傳多樣性結果推測，核型的變異或許不能使海南島油茶資源間的遺傳背景或遺傳多樣性變得豐富。目前，本課題組正在進行海南油茶資源的核型多樣性分析，并研究其與形態(tài)多樣性和遺傳多樣性的相關性，對上述推測進行驗證。

油茶在海南島有悠久的栽培歷史，現存的油茶居群均是人工栽種的半野生居群，海南島油茶資源表現出物種水平高于居群水平的遺傳多樣性，表明半野生海南油茶居群種源來源比較復雜，而同一居群種源來源相對穩(wěn)定。同時居群水平存在一定的遺傳變異，究其原因是這些居群均是以實生苗建成, 油茶是較為嚴格的蟲媒異花授粉植物，F1代實生苗分離的結果。

3.2 海南島油茶群體遺傳結構與親緣關系

油茶是較為嚴格的蟲媒異花授粉植物。Nybom[19]對31種雜交植物進行統(tǒng)計，平均G為0.22；張德全等[29]的統(tǒng)計表明，蟲媒植物的平均G為0.264。本研究中G為0.380 5，高于上述平均值，也比我國小果油茶遺傳分化值要高(=0.134 3)[16]，可見海南島油茶居群間具有較大的遺傳分化。此外，在整體水平上居群間的基因流為0.813 9，說明海南島油茶資源不同居群間存在較小的基因交流。遺傳分化系數顯示，海南油茶總的遺傳變異中有38.05%的變異存在于居群間，有61.95%的遺傳變異存在于居群內；在小果油茶總的遺傳變異中，居群內占86.58%，而居群間僅占13.42%[16]；Kaundun[30]利用RAPD-PCR標記對韓國、日本和臺灣27個優(yōu)良茶樹品種的多樣性進行了研究，顯示71%的變異位于組內，29%位于組間。本研究結論與其一致，其遺傳變異均以居群內變異為主。海南油茶資源31個居群間的遺傳距離為0.022 6~0.276 4，平均為0.107 7, 顯示較近的親緣關系，僅略高于廣布于我國南方的小果油茶(19個居群的遺傳距離為0.021 6~0.164 5，平均為0.098 8)[16]。聚類分析表明，在遺傳距離為0.11處，可將31個海南油茶居群聚為6類，聚類結果與行政區(qū)域有一定的相關性，但與各居群的地理距離不相關，除了來自?？诘木尤汉臀逯干骄尤翰荒芨髯跃蹫橐活愅猓渌锌h來源的居群均按行政區(qū)域聚為一類，表現出明顯的行政區(qū)域性。這與劉揚[31]應用ISSR標記對來自海南、廣西、江西的55份油茶資源進行多態(tài)性和聚類分析的結果基本一致，也同小果油茶的聚類結果相一致[16]?？梢?海南島油茶親緣關系較近，且表現出較強的行政區(qū)域性。我們推測，海南油茶資源居群的聚類關系可能與海南油茶悠久的引種栽培歷史, 以及計劃經濟體制下各行政區(qū)域的油茶推廣方式密切相關。

油茶為異花授粉植物，自交或近交不親和，結實率極低[32]。我們的調查表明，現有海南島油茶林分個體的開花率高，可達100%，花量也極大，但結果個體僅為20%左右，甚至更低，以致產量極低，這種現象在近5~10年栽植的油茶林分中也表現得更為突出[33]，極大地影響了農民種植油茶的信心和積極性。本研究表明海南島油茶資源親緣關系近,依據油茶自交不結實或結實率低的特性，因此，我們認為海南島油茶資源親緣關系近可能造成自交或近交不親和，是致使海南油茶林分花量大而結實低的主要內在原因之一。本課題組下一步將從小氣候對花粉活性和傳粉者行為的影響、土壤養(yǎng)分供給對結實的影響，以及林分個體間的遺傳親緣關系等方面進行分析和論證。

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Genetic Diversity Analysis ofResources Based on SRAP Markers in Hainan Island

CHEN Xuan1, YUN Yong1, WU Yu-jia2, QI Hua-sha1, YANG Li-rong1, CHEN Jia-li1, ZHENG Dao-jun1*

(1.Institute of Tropical Horticulture, Hainan Academy of Agricultural Sciences,Hainan Key Laboratory for Innovative Development and Utiliation of Tropical Special Economic Plants,Haikou 571100, China; 2. Institute of Agricultural Environment and Soil, Hainan Academy of Agricultural Sciences, Haikou 571100, China)

In order to evaluate genetic diversity ofresources in Hainan Island, the genetic diversity and relationship among 31 populations wereanalyzedby using SRAP molecular marker. The results showed that the genetic diversity ofresources in Hainan Island was low, the percentage of polymorphic bands (PPB), Nei’s genetic diversity index () and Shannon’s information index () were 98.30%, 0.222 8 and 0.353 8 at the species level, and 40.96%, 0.138 5 and 0.208 3 at the population level, respectively, which was inconsistent with their rich phenotypic diversity in Hainan. The coefficient of genetic differentiation among populations (G) was 0.380 5, and the gene flow (N) was 0.813 9 between different populations, indicating that genetic differentiation was high with limited gene flow among populations. The genetic variation mainly existed within populations (61.95%) and few among them (38.05%). The genetic distance ranged from 0.022 6 to 0.276 4, with the mean of 0.107 7 between 31 populations, which revealed the relatively close genetic relationship among the populations. UPGMA cluster analysis showed that 31 populations could be divided into 6 groups at the genetic distance of 0.11, showing obvious administrative area, but had little to do with geographical distance. So, it was suggested that the relatively close genetic relationship ofresources in Hainan Island might cause self-incompatibility, which could be the main internal cause for blooming but low yield offorests in Hainan Island.

; SRAP marker; Genetic diversity; Population; Hainan Island

10.11926/jtsb.4027

2018-12-04

2019-03-25

國家自然科學基金項目(31860082); 海南省省屬科研院所技術開發(fā)專項(KYYS-2018-14); 海南省農業(yè)科學院2018年度農業(yè)科技創(chuàng)新專項資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31860082), the Project for Technology Development of Hainan Provincial Scientific Research Institutions (Grant No. KYYS-2018-14), and the Project for Agricultural Science and Technology Innovation of Hainan Academy of Agricultural Sciences in 2018.

陳宣(1983~ )，男，碩士，副研究員。研究方向為熱帶經濟作物遺傳育種。E-mail: chenxuan06@sina.com

Corresponding author. E-mail: daojunzh@163.com