倪力軍，文丹瑤，胡甜甜，高麗麗，胡江寧，金漢臺，金志文，張立國*

(1.華東理工大學 化學與分子工程學院，上海 200237；2.中國醫(yī)學科學院藥物研究所，北京 100050；3.浙江康恩貝中藥有限公司，浙江 麗水 323400)

洋常春藤(HederahelixL.)為五加科常春藤屬常綠藤本植物，原產于歐洲，現于世界范圍內廣泛種植[1]。洋常春藤在歐美等地作為一種藥用植物，已被廣泛應用于咳嗽、哮喘和支氣管炎等呼吸道疾病的治療[2-4]，而在我國藥用研究很少。洋常春藤中除了含有研究最多的三萜皂苷類物質[5-6]，還含有黃酮類、聚乙炔、有機酸類、花色苷類、香豆素類、固醇類生物堿、揮發(fā)油、維他命等化合物[5-7]。深入研究洋常春藤的化學成分及生理活性，對于開發(fā)其藥用價值具有重要的經濟意義和社會效益。

藥理研究表明，常春藤皂苷是洋常春藤止咳化痰和抗炎的主要活性成分[8-9]，黃酮類和有機酸類化合物亦具有抗炎等藥效[10]。化學成分分析是對洋常春藤進行藥學研究的首要條件。目前，洋常春藤化學成分的定量分析主要采用高效液相色譜法(HPLC)，例如文獻[11-13]建立了測定洋常春藤中皂苷類物質的HPLC方法；文獻[14]建立了測定綠原酸、蘆丁、煙花苷、常春藤皂苷C、常春藤皂苷D和α-常春藤皂苷6種成分的HPLC方法；文獻[15]建立了測定綠原酸、蘆丁、白頭翁皂苷B4、常春藤皂苷C、常春藤皂苷D、川續(xù)斷皂苷乙、常春藤皂苷B和α-常春藤皂苷8種成分的HPLC方法，但上述方法的分析時長均在60 min以上。超高效液相色譜法(UHPLC)由于具有檢測時間短、溶劑用量少、高效、環(huán)保等優(yōu)點而被廣泛應用。為最大程度地保留藥材中的化學成分，并進行更全面、快速的成分分析，本文采用UHPLC法在27 min內對洋常春藤中的綠原酸和隱綠原酸2種有機酸，蘆丁、煙花苷2種黃酮類化合物以及常春藤皂苷C(HDC)、常春藤皂苷D(HDD)、常春藤皂苷B(HDB)和α-常春藤皂苷(α-H)4種主要皂苷成分進行同時定量分析，可為洋常春藤的藥學研究提供支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

Thermo UltiMate 3000高效液相色譜儀(Thermo Fisher Scientific有限公司)；ML104/02電子分析天平(Mettler Toledo有限公司)；M2P百萬分之一電子天平(Sartorius儀器系統(tǒng)有限公司)；DS-3510 DTH超聲波清洗器(上海生析超聲儀器有限公司)；UPK-I-10T去離子水機(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)；FW177中藥粉碎機(天津泰斯特儀器公司)；DHG-9070A電熱鼓風干燥箱、HWS-28電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料

乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)；無水甲醇、無水乙醇(分析純，上海泰坦科技有限公司)；磷酸(優(yōu)級純，上海麥克林生化科技有限公司)；甲酸(98%，上海凌峰化學試劑有限公司)；超純水為實驗室自制。

以洋常春藤干燥葉為研究對象，鮮葉采摘于浙江杭州和江蘇沭陽，分別于不同溫度下烘干至恒重，由浙江康恩貝中藥有限公司提供。樣品經中國中醫(yī)科學院中藥研究所陳士林教授鑒定為五加科常春藤屬常春藤HederahelixL.。

1.3 實驗方法

1.3.1 對照品溶液的配制精密稱取8種待測物對照品，以80%甲醇溶解，配成綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、煙花苷、HDC、HDD、HDB和α-H質量濃度分別為 0.108 1、0.105 0、0.118 4、0.109 3、1.032 2、1.023 3、0.948 4、1.062 5 mg·mL-1的混合對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備供試品溶液：稱取干燥藥材粉末(過40目篩)約0.5 g，以料液比1∶100加入80%甲醇，置于85 ℃水浴回流1 h，放冷，以80%甲醇補足失重，過0.22 μm有機相濾膜，取續(xù)濾液即得。

陰性供試品溶液：按照上述方法制備不含待測物的陰性供試品溶液。

1.3.3 色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；檢測波長：205 nm；柱溫：25 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：2 μL；流動相：A為0.05%磷酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫方式：0～3 min，5%～16%B；3～8 min，16%～19%B；8～9 min，19%～28%B；9～13 min，28%～31%B；13～14 min，31%～53%B；14～17 min，53%～65%B；17～17.1 min，65%～5%B；17.1～27 min，5%B。

圖1 不同流動相時的UHPLC色譜圖Fig.1 UHPLC chromatograms with different mobile phasesA.acetonitrile-water,B.acetonitrile-0.05%formic acid,C.acetonitrile-0.05%phosphoric acid;peaks：1.chlorogenic acid,2.cryptochlorogenic acid,3.rutin,4.nicotifiorin,5.HDC,6.HDD,7.HDB,8.α-H

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的組成考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液和乙腈-0.05%甲酸溶液等流動相體系的分離效果。結果表明，由于本實驗采用紫外檢測器，而甲醇的截止波長在205 nm左右，有機相使用甲醇會對測定影響較大，且系統(tǒng)壓力較高，對儀器及色譜柱損傷較大；采用乙腈在相同的流速和比例下系統(tǒng)壓力較小，且在短波長處乙腈的吸收小，不干擾目標物質測定，此外乙腈的洗脫能力較強，有利于目標物質的分離，因此有機相選用乙腈。

進一步研究發(fā)現，以乙腈-水為流動相時，綠原酸和隱綠原酸不出峰(圖1A)；以乙腈-0.05%甲酸溶液為流動相時，基線漂移較為嚴重(圖1B)；而以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相時8種目標物質均出峰(圖1C)，同時解決了基線漂移問題，因此采用乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相。

2.1.2 梯度條件的優(yōu)化洋常春藤中的有機酸、黃酮類和皂苷類成分的極性差別較大，故采用梯度洗脫程序。其中，綠原酸和隱綠原酸為同分異構體，兩者極性相近較難分離，有機相比例約在16%～18%時洗脫完全；蘆丁和煙花苷的極性相近較難分離，有機相比例約在28%～30%時洗脫完全；HDC和HDD的極性相近較難分離，有機相比例約在35%～38%時洗脫完全；HDB和α-H約在有機相比例為60%時洗脫完全。為使8種化學成分均能出峰，且極性相近物質的分離度達到要求和縮短測定時間，確定最佳梯度條件如“1.3.3”所示。

隨著時代的變化，現如今的中學生大都有著較差的獨立性，因此不管是在個人衛(wèi)生方面還是在學習中的集體衛(wèi)生方面都做得不到位，這樣的壞習慣也為傳染性疾病提供了有力的條件。其次現階段的中學生有較強的懶惰性，不注重身體的鍛煉，也使得自身的身體素質較差，很容易被疾病感染。所以在教學中教師可以采取有效的教學手段，培養(yǎng)學生養(yǎng)成良好的衛(wèi)生和生活習慣，加強學生對于疾病的防范意識。

2.1.3 檢測波長的選擇采用紫外可見分光光度法在200～400 nm對8種成分的對照品溶液進行全波長掃描，結果顯示綠原酸和隱綠原酸的最大吸收波長約為219 nm，蘆丁和煙花苷的最大吸收波長約為214 nm，HDC、HDD、HDB和α-H的最大吸收波長分別約為205、203、207、209 nm。由于皂苷類物質僅在低波長下有紫外吸收，為使所有物質均能出峰，本文選擇低波長進行檢測。

采用二極管陣列檢測器對樣品在190～800 nm波長進行紫外全波長掃描，結果顯示洋常春藤中的皂苷類物質在205 nm處有較強吸收，高波長處無紫外吸收。為檢測到更多的色譜峰，并使各主要成分的色譜峰響應最高，最終選擇最佳檢測波長為205 nm。

2.2 方法學考察

2.2.1 系統(tǒng)適應性及方法專屬性分別精密吸取“1.3.1”和“1.3.2”中的混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各2 μL，按“1.3.3”色譜條件進樣分析。結果顯示：供試品溶液中8種化學成分的色譜峰與混合對照品中各色譜峰的保留時間相對應(圖2)，陰性樣品在相應位置處未出峰，表明提取溶劑和提取方式對8種化學成分的測定無干擾，方法專屬性良好。各化學成分間的分離度均在1.5以上，峰形對稱，拖尾因子均在1.5以下，理論塔板數均不低于40 000(見表1)。

AnalyteRegression equationCorrelation coefficient(r)Linear range(mg·mL-1)Theoretical plate numberResolutionChlorogenic acid(綠原酸)y=192.238 6x-0.376 80.999 70.005 1～0.108 146 8912.45Cryptochlorogenic acid(隱綠原酸)y=157.375 7x-0.373 60.999 50.005 2～0.105 048 27924.04Rutin(蘆丁)y=426.169 2x+0.128 90.999 90.004 8～0.118 4103 7847.05Nicotifiorin(煙花苷)y=344.104 2x-0.078 00.999 60.004 8～0.109 3227 5304.30HDC(常春藤皂苷C)y=23.389 5x+0.165 60.999 90.041 9～1.032 2392 6943.02HDD(常春藤皂苷D)y=23.081 2x-0.180 00.999 80.045 0～1.023 3475 4126.73HDB(常春藤皂苷B)y=24.757 9x+0.067 30.999 80.039 5～0.948 4857 0454.65α-H(α-常春藤皂苷)y=45.269 6x+0.138 40.999 80.043 8～1.062 5897 2382.06

2.2.2 線性關系取“1.3.1”中混合對照品溶液，分別稀釋2、5、10、25倍，按“1.3.3”色譜條件進樣分析，以峰面積(mAU·min)為縱坐標(y)，對照品的質量濃度為橫坐標(x，mg·mL-1)進行線性回歸。由表1可知，各成分在相應質量濃度范圍內均呈良好的線性關系，相關系數r≥0.999 5，符合分析要求[16]。

2.2.3 檢出限與定量下限取“1.3.1”中配制的混合對照品溶液，逐級稀釋，按“1.3.3”進樣分析，分別以信噪比(S/N)為3和10時對應的質量濃度作為檢出限及定量下限，測得綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、煙花苷、HDC、HDD、HDB和α-H的檢出限分別為0.42、0.67、0.40、0.60、2.62、7.29、10.58、8.76 μg·mL-1，定量下限分別為1.45、2.24、1.31、2.00、8.38、23.25、34.61、29.20 μg·mL-1。

2.2.4 精密度實驗稱取1份洋常春藤干燥葉粉末(批號HZ170402)約0.5 g，按“1.3.2”方法制備供試品溶液，按“1.3.3”色譜條件重復進樣測定6次。結果顯示，綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、煙花苷、HDC、HDD、HDB和α-H峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.61%、0.67%、0.64%、0.68%、0.61%、0.57%、0.59%、0.63%，表明儀器精密度良好，符合分析要求[16]。

2.2.5 重復性實驗平行稱取6份洋常春藤干燥葉粉末(批號HZ170402)各約0.5 g，按“1.3.2”方法制備成6份供試品溶液，按“1.3.3”色譜條件進樣分析。結果顯示，綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、煙花苷、HDC、HDD、HDB和α-H峰面積的RSD分別為1.9%、1.4%、1.7%、1.1%、0.64%、0.78%、0.59%、1.3%，表明方法重復性良好，符合分析要求[16]。

2.2.6 穩(wěn)定性實驗稱取1份洋常春藤干燥葉粉末(批號HZ170402)約0.5 g，按“1.3.2”方法制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、24 h按“1.3.3”色譜條件進樣分析。結果顯示，綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、煙花苷、HDC、HDD、HDB和α-H峰面積的RSD分別為0.22%、0.55%、0.30%、0.25%、0.39%、0.67%、0.38%、0.29%，表明樣品溶液中各化學成分在室溫條件下24 h內穩(wěn)定性良好，符合分析要求[16]。

2.2.7 加標回收率實驗取已知含量的供試品溶液(藥材批號：HZ180801)6份，分別加入一定量的對照品，使綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、煙花苷、HDC、HDD、HDB、α-H的加標水平分別為0.013 5、0.013 7、0.014 6、0.008 7、0.103 9、0.018 4、0.019 2、0.101 4 mg，按“1.3.3”色譜條件進樣分析。測得上述成分的平均加標回收率分別為106%、102%、106%、106%、100%、97.3%、108%、101%，RSD分別為2.2%、2.8%、0.81%、0.51%、3.2%、0.91%、1.6%、2.4%。供試品溶液中除HDC和α-H外，其它6種組分的含量均小于1%，平均回收率均符合相應要求[16]，表明該方法的準確度良好。

2.3 樣品的測定

取10批洋常春藤干燥葉，按“1.3.2”方法制備成供試品溶液，按“1.3.3”條件進行測定，結果見表2。結果表明，8種成分在不同批次洋常春藤中的含量存在較大差異，其中HDC和α-H的含量相對較高，說明藥材產地、采摘期和炮制溫度均會對其含量產生影響。

表2 不同批次洋常春藤干燥葉中8種成分的含量Table 2 Contents of eight compounds in Hedera helix L.leaves in different batches

3 結 論

本文建立了同時測定洋常春藤中綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、煙花苷、常春藤皂苷C、常春藤皂苷D、常春藤皂苷B和α-常春藤皂苷含量的UHPLC方法。結果表明，該方法準確度高、重復性好，可用于洋常春藤中主要化學成分的快速定量分析，亦可用于洋常春藤提取物及制劑的含量分析，為建立洋常春藤藥材、提取物及制劑的質量標準提供了依據。