李鉑，唐志書*，王楠，孫曉春，黃文靜，宋忠興，楊新杰，程虎印，黃柯朝

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；2.秦藥特色資源研究與開發(fā)國家重點實驗室(培育)，陜西 咸陽 712083；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046

光是植物生長發(fā)育最重要的生態(tài)因子和調(diào)節(jié)因子之一[1]，適宜的光質(zhì)能夠影響藥用植物的初生代謝，調(diào)控不同次生代謝產(chǎn)物的積累和分配，從而影響藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。發(fā)光二極管(LED)作為新型光源，廣泛應(yīng)用于設(shè)施農(nóng)業(yè)、園藝作物、植物工廠等領(lǐng)域，在藥用植物人工栽培方面具有良好的應(yīng)用前景，無論是作為唯一光源或補充光源，可以通過精準(zhǔn)控制光照強度、混合光質(zhì)組合，提高藥用植物的產(chǎn)量和質(zhì)量。

七葉一枝花ParispolyphyllaSmith為百合科重樓屬多年生草本，又名重樓、蚤休、燈臺七、螺絲七[3]，主要分布于陜西南部、云南、四川、廣西、貴州等地，為特色秦藥之一[4]。重樓根和根莖入藥，富含皂苷類、多糖、三萜類、黃酮類等多種化合物，具有清熱解毒、消腫止痛等功效[5-6]。秦嶺地區(qū)氣候環(huán)境適宜，植被類型豐富，分布有七葉一枝花、寬葉重樓、柄葉重樓、北重樓等多種重樓屬植物[7-8]。重樓常生長于疏林下或灌叢陰濕處，喜涼爽、陰濕的環(huán)境，因此對光照強度和光質(zhì)的選擇較為敏感。

重樓作為傳統(tǒng)中藥，隨著市場需求不斷增加，野生資源遭到極度破壞，重樓人工種植技術(shù)的突破和改進迫在眉睫，研究光質(zhì)對重樓藥材產(chǎn)量和品質(zhì)的影響具有重要的指導(dǎo)意義。本研究通過設(shè)置5種不同光質(zhì)處理基質(zhì)栽培的陜產(chǎn)重樓，通過測定不同生長期重樓生物量、葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、總多糖和總皂苷含量，綜合多項指標(biāo)，評價陜產(chǎn)重樓對不同LED光質(zhì)的響應(yīng)機制，為重樓藥材規(guī)范化種植過程中最適光質(zhì)的選擇提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)；UV-2600紫外可見分光光度計(日本Shimadzu公司)；萬分之一電子天平(日本Shimadzu公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器公司)。

1.2 試藥

葡萄糖(批號：180519)、重樓皂苷I(批號：180607)購自陜西樂博生化有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010S)、總SOD活性檢測試劑盒(S0101)購自上海碧云天生物科技公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

三年生重樓幼苗采自陜西省商洛市鎮(zhèn)安縣云蓋寺鎮(zhèn)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤教授鑒定為百合科重樓屬植物七葉一枝花P.polyphylla。取30 cm×25 cm塑料盆，裝入適量基質(zhì)(PindStrup，Denmark，粒徑0～6 mm，pH 6.0)；挑選大小一致的重樓幼苗，洗凈，栽植于基質(zhì)內(nèi)，使芽尖露出基質(zhì)表面，置于組織培養(yǎng)間培養(yǎng)(20 ℃，12 h光照/12 h黑暗，相對濕度55%～60%)，待葉片完全展開，用于不同光質(zhì)處理。

1.3 方法

1.3.1 LED光源設(shè)置 分別設(shè)置LED紅光、藍(lán)光、紅光/藍(lán)光4∶1、紅光/藍(lán)光2∶1不同光質(zhì)，不同顏色燈珠按比例均勻交叉排布，以白色熒光燈為對照(FL，T5，飛利浦照明工業(yè)有限公司)，調(diào)整光源數(shù)量和高度，使距離重樓葉片處的平均光照強度為80 μmol·(m2·s)-1。每個處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)30株苗，光周期：12 h光照/12 h黑暗(20 ℃、相對濕度55%～60%)，分別于處理10、20、30 d時取樣，新鮮樣品經(jīng)液氮速凍，存于-80 ℃冰箱，用于葉綠素含量、蛋白含量和SOD酶活性測定；另取不同處理的重樓根莖洗凈，40 ℃烘干，粉碎過篩，用于多糖和總皂苷含量測定。LED光源由廣東偉照業(yè)光電節(jié)能有限公司制造，單支LED光源的相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 LED光源相關(guān)參數(shù)

注：峰值波長代表不同LED光源的光強達到最大時對應(yīng)的波長；—表示白光為全波長；組合光質(zhì)的該值為兩種LED光源各自的峰值波長。

1.3.2 生物量測定 不同光質(zhì)處理30 d后取樣一次，各處理隨機取樣3株，洗凈，拭干水分，分別測定并記錄地上部分與根莖的質(zhì)量，根據(jù)公式(1)計算根冠比。

根冠比=地下部分(g)/地上部分(g)

(1)

1.3.3 葉綠素含量測定 精密稱取處理30 d的新鮮重樓葉片各0.1 g，洗凈，擦干，剪碎，加入適量80%丙酮，研磨至組織變白，過濾至25 mL容量瓶，定容，每個處理重復(fù)3次。分別在663、646 nm處測定提取液吸光值，按照文獻描述方法計算葉綠素a和葉綠素b含量[9]。

1.3.4 總蛋白含量與SOD酶活性測定 分別取不同光質(zhì)處理10、20、30 d的新鮮重樓葉片，洗凈雜質(zhì)，吸干水分，精確稱取0.5 g，加入5.0 mL磷酸緩沖液(0.05 mol·L-1，pH 7.8)，冰上迅速研磨成勻漿，4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min，上清液用于蛋白含量測定和SOD酶活性測定。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定葉片中蛋白含量，蛋白含量以mg·g-1FW(鮮質(zhì)量)表示；利用總SOD活性檢測試劑盒測定葉片中超氧化物歧化酶活性，SOD酶活力以U·mg-1蛋白含量表示。

1.3.5 總多糖含量測定

1.3.5.1 重樓粗多糖的制備 精密稱取重樓樣品0.250 g，置于錐形瓶中，加入10 mL蒸餾水，60 ℃超聲20 min，濾取上清液，向沉淀中加入10 mL蒸餾水，重復(fù)上述操作。合并兩次水提液，加入無水乙醇，使乙醇終濃度為80%。4 ℃靜置24 h，10 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，40 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，得到重樓粗多糖粉末。向烘干的粗多糖粉末中加入25 mL蒸餾水，充分溶解，備用。

1.3.5.2 重樓多糖含量測定 重樓多糖含量采用苯酚-硫酸法進行測定[10]。精密量取0.2 mg·mL-1葡萄糖對照品溶液0、25、50、150、250、300 μL，蒸餾水補體積至300 μL，加入5%苯酚溶液1 mL，混勻；加入濃硫酸5 mL，搖勻并靜置10 min，40 ℃水浴15 min；取出后冰浴10 min，測定490 nm處吸光值。以葡萄糖對照品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，得到如下線性回歸方程：Y=9.941 8X+0.015 5，r=0.995 5(n=3)。分別吸取1.3.5.1項中待測樣品300 μL，按相同方法測定490 nm處吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量，多糖含量以mg·g-1DW(干質(zhì)量)表示。

1.3.6 總皂苷含量測定 精密稱取重樓根莖粉末0.2 g，置于具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，超聲提取15 min，用甲醇補足減少的質(zhì)量。參考楊驍?shù)萚11]的方法進行測定，以重樓皂苷I作為對照品，重樓皂苷I含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得到如下線性回歸方程：Y=3.026 8X-0.013 7，r=0.996 7(n=3)，表明重樓皂苷I在0～0.023 mg·mL-1線性關(guān)系良好。總皂苷含量以mg·g-1DW(干質(zhì)量)表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2013和SPSS 22.0軟件，采用單因素方差分析結(jié)合多重比較進行多組樣本間的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同LED光質(zhì)對重樓生物量的影響

由表2可知，不同光質(zhì)處理重樓植株30 d后，地上部分與根莖的生物量略有變化，2R1B處理的重樓地上部分生物量達到最大，地下部分生物量以4R1B處理為最高，但不同處理組與對照組相比均未達到顯著差異。同時，藍(lán)光和紅光/藍(lán)光2∶1處理的重樓根冠比減小，表明其對重樓地上部分生長的促進作用高于地下部分。

表2 不同LED光質(zhì)對重樓生物量的影響

2.2 不同LED光質(zhì)對重樓葉綠素含量的影響

重樓葉片中葉綠素含量在不同光質(zhì)處理后變化明顯。葉綠素a含量在R、B與2R1B光質(zhì)處理后均顯著增加，分別為對照組的1.331倍(P<0.05)、1.432倍(P<0.01)和1.521倍(P<0.01)。不同處理組葉片中葉綠素b含量均低于葉綠素a，B與2R1B處理組葉綠素b含量均顯著高于白光處理(CK)，分別為對照組的1.269倍(P<0.05)和1.445倍(P<0.01)，見圖1。結(jié)果表明，藍(lán)光和紅光/藍(lán)光2∶1處理均可顯著提高陜產(chǎn)重樓葉片中兩種葉綠素含量，以后者的處理效果為佳，其對重樓植株光合的影響有待進一步研究，以探明葉綠素含量增加與光合作用變化之間的關(guān)系。

注：Chl a.葉綠素a；Chl b.葉綠素b；分別以白光處理作為對照，*P<0.05；**P<0.01。圖1 不同LED光質(zhì)對重樓葉片中葉綠素含量的影響

2.3 不同LED光質(zhì)對重樓葉片蛋白含量和SOD酶活性的影響

不同光質(zhì)處理重樓植株，葉片中總蛋白含量相比對照組顯著增加。B、4R1B和2R1B處理10 d后葉片中蛋白含量均顯著增加，分別為對照組(白光)的1.741倍、1.312倍和1.313倍；不同光質(zhì)處理重樓植株20 d，各處理組葉片蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在(69.579±2.100)～(92.171±2.286)mg·g-1FW；處理30 d后，不同光質(zhì)處理的葉片中蛋白含量均顯著高于對照組，以紅/藍(lán)2∶1處理的蛋白含量為最高，是對照組的1.628倍(P<0.01)，藍(lán)光處理的重樓葉片蛋白含量為對照組的1.523倍，亦達到顯著差異(圖2)。因此，單色光以藍(lán)光處理的重樓葉片蛋白含量增加明顯，不同比例光質(zhì)以紅光/藍(lán)光2∶1處理對重樓葉片蛋白積累的促進作用顯著。實際生產(chǎn)中可通過調(diào)整紅藍(lán)光質(zhì)配比，提高重樓葉片中的蛋白質(zhì)含量。

注：分別以白光處理作為對照，*代表P<0.05；**代表P<0.01。圖2 不同LED光質(zhì)對重樓葉片蛋白含量的影響

由圖3可知，不同光質(zhì)處理初期(10 d)，紅光和紅光/藍(lán)光4∶1處理的重樓葉片中SOD酶活性相比對照組(白光)有所上升。隨著處理時間的增加，各處理組葉片SOD酶活性相比對照均有所下降，以藍(lán)光和紅/藍(lán)2∶1處理組酶活性下降幅度明顯。處理30 d時，B、4R1B和2R1B處理的葉片中SOD活性均顯著降低，分別為(1.398±0.077)、(1.301±0.104)、(0.979±0.058)U·mg-1，均低于對照組葉片中SOD酶活性，以紅光/藍(lán)光2∶1處理的葉片SOD酶活性降幅為最大，相比對照組降低55.40%(P<0.01)。

注：分別以白光處理作為對照，*P<0.05；**P<0.01。圖3 不同LED光質(zhì)對重樓葉片SOD酶活性的影響

2.4 不同LED光質(zhì)對重樓總多糖含量的影響

本研究中，不同光質(zhì)不同時間處理的陜產(chǎn)重樓根莖中多糖含量相比對照組(白光)明顯升高。不同處理時間R、B和2R1B處理的重樓根莖中，多糖含量均在較高水平，以紅光/藍(lán)光2∶1處理的促進作用最為顯著，分別為對照組的1.918倍(10 d)、2.165倍(20 d)和3.151倍(30 d)。隨著紅光/藍(lán)光4∶1處理時間的延長，對重樓根莖中多糖含量的積累由抑制轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M，處理30 d后根莖中多糖含量達(25.738±2.362)mg·g-1DW，顯著高于對照組(P<0.01，圖4)。綜合考慮，以紅光/藍(lán)光2∶1為提高陜產(chǎn)重樓根莖中多糖含量的最佳LED光質(zhì)處理組合。

注：分別以白光處理作為對照，**P<0.01。圖4 不同LED光質(zhì)對重樓根莖中多糖含量的影響

2.5 不同LED光質(zhì)對重樓總皂苷含量的影響

由圖5可知，不同光質(zhì)處理的重樓根莖中，重樓總皂苷含量隨處理時間的延長總體表現(xiàn)為逐漸升高的趨勢。紅光和藍(lán)光處理10 d，重樓根莖中總皂苷含量均顯著高于對照(白光)，以藍(lán)光處理的效果為好，達到(44.766±1.445)mg·g-1DW，相比對照組提高91.20%(P<0.01)。處理20 d時不同處理之間總皂苷含量無顯著差異。不同光質(zhì)處理30 d時，總皂苷含量相比對照組均有所增加，以藍(lán)光處理的促進作用為最強，達到(63.343±4.269)mg·g-1DW，是對照組的1.595倍(P<0.01)。因此，藍(lán)光對陜產(chǎn)重樓根莖中總皂苷積累的促進作用最為顯著。

注：分別以白光處理作為對照，*P<0.05；**P<0.01。圖5 不同LED光質(zhì)對重樓根莖中總皂苷含量的影響

3 討論

光是藥用植物積累同化產(chǎn)物的能量來源，次生代謝產(chǎn)物的合成與積累則依賴于植物體內(nèi)的初生代謝。研究表明，不同光質(zhì)的LED光源能夠影響植物的生長[12-13]、光合作用[14]、保護酶系統(tǒng)[15]，以及次生代謝產(chǎn)物的積累與轉(zhuǎn)化[16-17]。陜產(chǎn)重樓是秦巴山區(qū)特色秦藥之一，隨著市場需求的不斷增加，解決重樓人工栽培過程中的關(guān)鍵性問題迫在眉睫。本研究利用LED發(fā)光二極管，設(shè)置不同單色光質(zhì)及混合光質(zhì)組合，處理基質(zhì)栽培的陜產(chǎn)重樓，分別考察植株生長、葉綠素含量、蛋白含量、超氧化物歧化酶活性、多糖含量和總皂苷積累對不同光質(zhì)的響應(yīng)。結(jié)果表明，紅光/藍(lán)光2∶1處理對重樓生長和生物量積累具有一定的促進作用，并能夠顯著提高葉片中葉綠素a、b的含量。葉綠素含量水平與植物的光合作用密切相關(guān)，黃希等[18]研究發(fā)現(xiàn)，橙光/藍(lán)光4∶1有利于促進滇重樓葉片的光合作用，本研究中紅光/藍(lán)光2∶1對陜產(chǎn)重樓光合作用的影響有待進一步探究。同時，本研究結(jié)果顯示，紅光/藍(lán)光2∶1處理對重樓葉片蛋白質(zhì)含量具有顯著的促進作用，并能夠顯著降低葉片超氧化物歧化酶活性。

聞永慧等[19]利用不同光質(zhì)LED處理白及二倍體與四倍體組培苗，發(fā)現(xiàn)紅/藍(lán)1∶1最有利于白及組培苗中多糖的積累；紅藍(lán)LED復(fù)合光照有利于鐵皮石斛葉綠素與多糖含量的增加，藍(lán)光則有利于種苗的增粗與生物堿的積累[16]。張勤濤等[20]利用藍(lán)光處理滇重樓，重樓產(chǎn)量及根莖中皂苷含量達到最高。重樓主要以根莖入藥，皂苷和多糖為根莖的主要成分。本研究結(jié)果顯示，紅光/藍(lán)光2∶1處理可顯著提高陜產(chǎn)重樓根莖中多糖的含量，而總皂苷含量的提高以LED藍(lán)光處理的效果為佳，這與上述文獻報道的結(jié)果基本一致。

LED光源是設(shè)施農(nóng)業(yè)常用的技術(shù)手段之一，具有高效、節(jié)能、環(huán)保等優(yōu)點，隨著珍稀藥用植物人工種植規(guī)模的擴大，充分利用LED光源在植株生長和有效成分積累關(guān)鍵期進行處理，可為提高藥材產(chǎn)量和品質(zhì)提供參考。同時，進一步研究不同LED光質(zhì)處理藥用植物后體內(nèi)初生代謝與次生代謝之間的轉(zhuǎn)化，以及關(guān)鍵酶基因的表達、調(diào)控過程，闡明不同光質(zhì)影響藥用植物生長和藥材品質(zhì)形成的分子機制，可為合理利用LED光源指導(dǎo)藥材生產(chǎn)提供理論和實踐依據(jù)。