劉維雅，尹海波，谷靜逸，李旭，張堇訸，鄧聰，王娜，任雪

1.遼寧省衛(wèi)生健康委員會，遼寧 沈陽 110000；2.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 大連 116600

孢粉與其他生殖器官一樣，較少受環(huán)境的影響，其形態(tài)較為穩(wěn)定，且Erdtman[1]認為，利用花粉粒形態(tài)特征可以提高一些植物分類精確度，對于種內(nèi)分類具有重要意義。近年來，不少學者借助SEM觀察植物的花粉形態(tài)，對同屬植物不同種或品種進行分類鑒定，為探究種間親緣關(guān)系提供參考[2-3]。老鸛草為我國常用中藥，全草入藥，具有祛風除濕的功效；目前關(guān)于老鸛草屬植物花粉形態(tài)的報道中，光景森、Yanazaki等[4]分別對牻牛兒苗、老鸛草屬20種植物進行花粉粒形態(tài)的描述；譚仲明等[5]曾對四川省老鸛草屬植物的花粉形態(tài)進行觀察研究，具有一定的系統(tǒng)學意義，但并未生成較為系統(tǒng)的分類依據(jù)；劉娟等[6]曾對黑龍江省4種老鸛草屬植物的花粉形態(tài)進行研究，但并未做分類研究；尹海波[7]曾對東北地區(qū)9種老鸛草屬植物的花粉進行光鏡觀察，并編寫分類檢索表。我國有老鸛草屬植物55種[8]，其中分布于遼寧省的有7種[9]，目前尚無文獻對遼寧老鸛草屬植物的分類進行系統(tǒng)梳理，闡明老鸛草屬植物是否存在分類爭議，故本文利用掃描電子顯微鏡對遼寧省老鸛草屬植物花粉形態(tài)特征進行觀察，通過花粉形態(tài)的差異對7種老鸛草進行聚類分析，并編寫分類檢索表，為老鸛草屬植物種類鑒定和分類提供更多依據(jù)，以期為該屬植物的孢粉學研究提供新資料。

1 材料與方法

1.1 材料

花粉材料均于2015年8—9月采自遼寧省東部山區(qū)，并經(jīng)大連自然博物館張淑梅教授和遼寧中醫(yī)藥大學藥用植物教研室尹海波教授鑒定。樣品來源信息見表1。

1.2 方法

取成熟飽滿的花蕾，置于硫酸紙袋中，硅膠干燥，用鑷子分別將干燥花粉均勻鋪置于1 cm×1 cm的導電雙面膠帶上，另一面黏在掃描電鏡樣品臺上，用離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍上一層15 nm厚的金膜。將處理好的樣品放入樣品盒中，用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SU8010日立)進行掃描、拍照。

1.3 統(tǒng)計分析

每種隨機選取成熟飽滿的花粉粒20粒，花粉粒大小用極軸長(E)×赤道軸長(P)表示，極軸和赤道軸比(P/E)表示花粉粒形狀，P/E在0.88～1.14為近球形[10]。在掃描電鏡下對表面紋飾棒狀體、網(wǎng)眼、溝寬和溝深進行觀察并測量，采用SPSS軟件分別計算均值和標準差，然后對7種老鸛草之間的大致親緣關(guān)系進行聚類、編寫檢索表。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉大小和形態(tài)特征

在掃描電鏡下，7種老鸛草屬植物的花粉粒均為近球形；不同種老鸛草屬植物的花粉粒大小差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中毛蕊老鸛草的花粉粒最大，其次分別為突節(jié)老鸛草和朝鮮老鸛草、長白老鸛草、塊根老鸛草、老鸛草，鼠掌老鸛草的花粉粒最小，該結(jié)果與原植物花直徑的大小一致，即花粉粒大的花朵也大。另外，花粉粒具3孔溝，溝短，3條孔溝作120°等分分布，部分孔溝有清晰的內(nèi)含物，可作為遼寧省老鸛草屬植物花粉的主要鑒別特征。詳見表2和圖1。

表1 老鸛草屬植物樣品基本信息

表2 7種老鸛草屬植物花粉形態(tài)特征的比較(n=3)

注：同一列不同字母表示差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05。

注：a.赤道面觀；b.極面觀；c.外壁一紋飾；d.外壁二紋飾；1.老鸛草；2.鼠掌老鸛草；3.塊根老鸛草；4.突節(jié)老鸛草；5.朝鮮老鸛草；6.長白老鸛草；7.毛蕊老鸛草。圖1 掃描電鏡下老鸛草屬7個種的花粉形態(tài)

2.2 花粉外壁紋飾

孢子花粉的外壁紋飾是細分孢子屬種的重要特征之一[10]。本實驗的7種老鸛草屬植物花粉均為復合紋飾，外壁一為短棒狀紋飾，外壁二為網(wǎng)狀紋飾。但棒狀形態(tài)及大小、網(wǎng)紋均勻程度和大小有較明顯差異，見表2。其中，網(wǎng)眼大小、萌發(fā)溝寬和溝深經(jīng)方差分析后差異有統(tǒng)計學意義，而棒狀體的差異主要體現(xiàn)在其形態(tài)和大小均勻程度上。

2.3 聚類分析

用歐式距離法對赤道軸長、極軸長、棒狀體大小、網(wǎng)眼大小、赤道面觀中的溝寬和溝深6個指標進行聚類分析，見圖2。若以鏈接距離17來劃分，7種老鸛草大致可分為兩類，突節(jié)老鸛草、朝鮮老鸛草、毛蕊老鸛草為一類，老鸛草、鼠掌老鸛草、塊根老鸛草和長白老鸛草為一類。其中，老鸛草和鼠掌老鸛草親緣關(guān)系最為接近，突節(jié)老鸛草和毛蕊老鸛草的親緣關(guān)系較為接近，該歸類結(jié)果與ISSR分子標記的親緣關(guān)系聚類結(jié)果稍有出入[11]，但可將大花組和小花組完全分開。

2.4 花粉特征檢索表

花粉作為植物的保守結(jié)構(gòu)，其形態(tài)特征具有可遺傳性，同時具有科屬的共同特征和種的特異性，可將花粉形態(tài)特征作為植物的分類依據(jù)[10]。

3 結(jié)論與討論

3.1 對遼寧省老鸛草屬植物的考證

據(jù)《中國植物志》記載，北方老鸛草G.erianthumDC.產(chǎn)于吉林省東部；《東北草本植物志》收錄老鸛草屬植物共9種，其中記載遼寧省內(nèi)有6種，另記載北方老鸛草在吉林省多個縣內(nèi)均有分布；《遼寧植物志》共收載老鸛草屬植物7種，亦未將毛蕊老鸛草G.eriostemonFish.ex DC.列入其中，而將G.erianthumDC.收錄。本實驗取材主要基于以下兩點：一是《中國植物志》第43卷成書于1997年，《東北草本植物志》第6卷成書于1977年，《遼寧植物志》成書于1988年。不難推測，《東北草本植物志》對遼寧省僅有6種的記載實為紕漏，成書最晚的《中國植物志》明確收載于《遼寧植物志》的G.erianthumDC.一種產(chǎn)于吉林省，該說法與《東北草本植物志》的信息一致，而G.erianthumDC.和G.eriostemonFish.ex DC.在親緣關(guān)系上極為相近[11]，因此，初步判斷《遼寧植物志》對G.erianthumDC.

1.花粉粒較大，大于(90×90)μm2

2.外壁一紋飾的棒狀大小無明顯差異

G.krameriFranch.et Sav.Enum.

2.外壁一紋飾的棒狀大小差異明顯

3.棒狀末端表面具一條帶狀凸起

G.paishanenseY.L.Chang.

3.棒狀末端表面具多條帶狀凸起 …………………………………………………G.eriostemonFish.ex DC.

1.花粉粒較小，<(90×90)μm2

4.外壁一紋飾的棒狀大小差異明顯

G.koreanumKom.in Act.

4.外壁一紋飾的棒狀大小無明顯差異

5.棒狀體末端表面具瘤狀凸起

G.sibiricumL.

5.棒狀體末端表面具帶狀凸起

6.外壁二網(wǎng)狀紋飾的網(wǎng)眼直徑>2 μm

G.eranimdahuricumDC.

6.外壁二網(wǎng)狀紋飾的網(wǎng)眼直徑<2 μm …………………………………………G.wilfordiiMaxim.

圖2 7種老鸛草屬植物花粉特征聚類分析

很可能為誤定。二是在實地考察中，2014、2015年6—9月在遼寧省調(diào)查了近200個天然山區(qū)，其中包括《遼寧植物志》中對G.erianthumDC.有收錄的桓仁、寬甸等山區(qū)，并未發(fā)現(xiàn)G.erianthumDC.，而G.eriostemonFish.ex DC.在遼寧山區(qū)尤其本溪縣內(nèi)普遍分布較多；后又考察了中國科學院沈陽生態(tài)所(中國科學院林業(yè)土壤研究所前身)的憑證標本，該標本現(xiàn)無根部、無花果部位，唯有3大3小葉片存留，雖葉裂均至3/4處，但就目前不完整的信息并不能排除是G.eriostemonFish.ex DC.的可能性。此外，曾在該所G.erianthumDC.標本的標注地區(qū)桓仁老禿頂多次進行較大規(guī)模的考察，依然未能發(fā)現(xiàn)該種。綜合以上兩點考證，筆者可初步斷定遼寧省的老鸛草屬植物共7種，分別為G.wilfordiiMaxim.、G.sibiricumL.、G.eranimdahuricumDC.、G.krameriFranch.et Sav.Enum.、G.koreanumKom.in Act.、G.paishanenseY.L.Chang.和G.eriostemonFish.ex DC.，而更正了《遼寧植物志》中的G.erianthumDC.，結(jié)論為老鸛草屬植物的開發(fā)利用和擴大藥源提供了參考。

3.2 花粉形態(tài)特征在屬下階元劃分的意義

據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)，7種老鸛草外觀形態(tài)差異極小，僅從葉片的分裂個數(shù)及花的大小來進行區(qū)別。而在掃描電鏡下，7個老鸛草屬植物的花粉均為近球形，三萌發(fā)孔，溝短而粗，表面均為棒狀-網(wǎng)紋復合紋飾，表明老鸛草屬植物這一自然類群具有較穩(wěn)定的共同特征。該7種老鸛草屬植物的花粉表面雖同為棒狀-網(wǎng)狀復合紋飾，但在花粉大小、棒狀形態(tài)及大小、網(wǎng)紋飾均等程度和大小、萌發(fā)孔溝寬、溝深等方面均有不同程度的差異。而這些差異表明以上特征在植物分類和開發(fā)藥用資源上具有重要的分類學價值，但是否可以作為該屬植物分類、鑒定的重要依據(jù)還需對其他老鸛草屬植物的花粉作進一步相關(guān)研究后方可得知，目前僅能對遼寧省內(nèi)的老鸛草屬植物進行初步分類。

3.3 關(guān)于聚類分析與傳統(tǒng)分類結(jié)果不完全相符問題

首先，在依據(jù)外部形態(tài)對屬下系劃分的傳統(tǒng)分類下，突節(jié)老鸛草和塊根老鸛草的親緣關(guān)系最為接近的觀點已由ISSR分子標記技術(shù)研究證實[12]，而圖2的聚類結(jié)果表明，突節(jié)老鸛草和毛蕊老鸛草的親緣關(guān)系最為接近，進而表明花粉粒特征的系統(tǒng)聚類并不能夠反映遼寧省內(nèi)老鸛草屬不同種之間的親緣關(guān)系。但聚類結(jié)果卻準確地將原植物形態(tài)上的大花組和小花組劃分開來，而塊根老鸛草和突節(jié)老鸛草雖然外觀形態(tài)極為相似，親緣關(guān)系也最為接近，但兩者最顯著的差異在于花的大小，突節(jié)老鸛草花直徑在2～3 cm，塊根老鸛草花直徑1.5 cm左右。因此，根據(jù)花粉形態(tài)特征將塊根老鸛草與花直徑<2 cm的老鸛草和鼠掌老鸛草歸為一類，實由原植物花本身特征所決定，雖與全株的親緣關(guān)系略有差異，卻也在情理之中；其次，本文的數(shù)據(jù)源于每種20?；ǚ鄣拇笮?，20個紋飾指標觀測值，最終比較均值，觀察數(shù)量的有限難免也會對聚類結(jié)果產(chǎn)生一定影響；再者，從SEM鏡下不難看出，一些花粉?；蚨嗷蛏儆凶冃维F(xiàn)象產(chǎn)生，加之測量的人為誤差，個別數(shù)據(jù)的不準確亦可能影響聚類結(jié)果。但靠孢粉學證據(jù)對遼寧省的老鸛草種進行分類已可初步實現(xiàn)，而對親緣關(guān)系的考察無法單靠孢粉學證據(jù)完成，卻在老鸛草屬植物種的分類上具有一定的實際意義，該結(jié)果可為老鸛草屬植物的資源開發(fā)奠定一定的基礎(chǔ)。