柯 野, 謝 濤, 衛(wèi)孟瑤, 樊銀鳳, 余 健
(韶關(guān)學院英東生命科學學院,廣東 韶關(guān) 512005)
蛋白酶是非常重要的工業(yè)酶制劑之一,占有全球整個工業(yè)酶使用量的60%以上;堿性蛋白酶制劑又占整個蛋白酶制劑的一半以上,廣泛應(yīng)用于皮革、食品和醫(yī)藥等多種領(lǐng)域;目前商品化應(yīng)用最為廣泛的堿性蛋白酶制劑大部分來源于植物和細菌,較少來源于霉菌[1].在食品工業(yè)中,利用固態(tài)發(fā)酵霉菌產(chǎn)生的蛋白酶水解大豆制備的傳統(tǒng)食品,具有口感豐富、風味濃郁、生理活性多樣的特點,備受消費者喜愛[2].
醬油曲霉(Aspergillussojae)是傳統(tǒng)食品發(fā)酵(如豆腐乳、米酒、醬油等)的重要菌種之一,該菌能產(chǎn)生多種酶類,如蛋白酶、淀粉酶和谷氨酰胺酶等[3-4].在所產(chǎn)生的酶中,堿性蛋白酶對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的風味、水解產(chǎn)物的脫苦味起關(guān)鍵作用[5-6].目前對該堿性蛋白酶的異源表達、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等相關(guān)研究未見報道.本課題組在前期的研究中已對醬油曲霉堿性蛋白酶(alkaline protease, Ap)基因在畢赤酵母中成功地進行了異源表達,對其酶學性質(zhì)進行了研究報道[7].該酶的體外穩(wěn)定性較差,通過分子定向進化增強其穩(wěn)定性,是其工業(yè)化應(yīng)用的前提.對于提高酶穩(wěn)定性而言,增加二硫鍵用以提高酶熱穩(wěn)定性是方法之一,有研究表明[8],增加米赫根毛霉脂肪酶中的二硫鍵,可提高該酶的熱穩(wěn)定性;同時酶結(jié)合金屬離子提高熱穩(wěn)定性和抗水解性也是備受大家關(guān)注的[9-10].本研究在前期基礎(chǔ)上,通過理性設(shè)計和定點突變技術(shù),致力于探究通過增加二硫鍵和Ca2+結(jié)合殘基提高Ap穩(wěn)定性,為其工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù).
1.1.1 菌株、酶和試劑 野生型Ap的重組工程菌株和Escherichia.coliDH 5α菌株由本實驗室提供;表達載體pPIC9K和畢赤酵母(Pichiapastoris) KM71菌株購自Invitrogen公司.TaKaRa MutanBEST Kit、PCR反應(yīng)體系、PCR產(chǎn)物回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒等購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司.其他化學試劑均分析純.
1.1.2 培養(yǎng)基E.coliDH 5α菌株采用LB 培養(yǎng)液培養(yǎng),酵母轉(zhuǎn)化子采用MD平板篩選,酵母菌采用YPD培養(yǎng)液培養(yǎng),酵母工程菌株采用BMGY和BMMY培養(yǎng)液誘導表達.
1.1.3 各種引物 Ap基因的表達引物(P1和P2)和定點突變引物的序列見表1,引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成提供.
表1 各種引物序列1)Table 1 Primers sequences
1)單下劃線為限制性內(nèi)切酶位點;雙下劃線為6×His tag;斜體加粗為定點突變位點.
1.2.1 Ap基因序列及其空間結(jié)構(gòu)的分析 采用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對Ap信號肽預(yù)測、SWISS MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)對Ap同源建模、Discovery studio 2.5軟件和Swiss-Pdb Viewer 4.0.3等軟件分析Ap序列和結(jié)構(gòu).
1.2.2 突變位點的選擇 以Ap的3-D結(jié)構(gòu)作為基礎(chǔ),利用Disulfide by Design(Version 1.20)軟件對Ap中能形成二硫鍵的殘基位點進行預(yù)測;結(jié)合模板3f7o.1.A與AP氨基酸序列的比對結(jié)果,以及3f7o.1.A自身形成二硫鍵的殘基位點,篩選出Ap中能形成二硫鍵的最大可能性的殘基位點.
分析3f7o.1.A中Ca2+結(jié)合的氨基酸殘基,確定Ca2+結(jié)合的具體原子,再以Ap的3-D結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),對Ap和3f7o.1.A中空間結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的比對,預(yù)測Ap結(jié)構(gòu)中與Ca2+結(jié)合的氨基酸殘基.
1.2.3 定點突變的方法 利用TaKaRa MutanBEST Kit定點突變試劑盒,按照試劑盒上的操作指導進行定點突變,然后將突變基因送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序確認.
1.2.4 突變基因在畢赤酵母中的異源表達 分別用表達引物P1和P2對T179G、D200G、T179G-D200G、G32C-S125C、S178C-T252C、G32C-S125C/S178C-T252C突變基因進行PCR擴增后,用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后的PCR產(chǎn)物連接至pPIC9K表達載體上,化轉(zhuǎn)至E.coliDH5α中培養(yǎng),提取重組質(zhì)粒,SacⅠ酶線性化,電轉(zhuǎn)至畢赤酵母KM71菌株中,MD平板培養(yǎng)篩選重組菌株,提取該菌株的基因組,基因組PCR鑒定突變基因整合至畢赤酵母基因組中的情況.將陽性酵母轉(zhuǎn)化子接種至裝有50 mL BMGY的500 mL三角瓶中培養(yǎng)2~3 d后,轉(zhuǎn)接至裝有50 mL BMMY的500 mL三角瓶中,每24 h向BMMY中添加1.0%(體積分數(shù))的甲醇作為誘導劑進行誘導,誘導7 d后,8 000g離心5 min收集上清液,測定酶活性和SDS-PAGE電泳鑒定后,放置4 ℃?zhèn)溆?
1.2.5 Ap的分離純化及熱穩(wěn)定性的測定 對Ap的純化采用以下步驟:向1.2.4獲得的上清液中,分級添加硫酸銨固體至飽和度為85%,4 ℃鹽析過夜后,10 000 r·min-1離心10 min,收集蛋白沉淀.用緩沖液溶解蛋白沉淀,透析過夜獲得粗酶液后,用鎳柱(HisTrap FF 5 mL, GE healthcare) 進行親和層析,然后Sephadex G-75進行分子篩層析收集洗脫液、濃縮獲得重組Ap.
酶活性測定法,將純化的Ap和底物的混合反應(yīng)體系置于不同的反應(yīng)溫度中,測定其相應(yīng)的酶活,用以探究反應(yīng)溫度.將Ap放置于不同的溫度水浴中,處理不同時間后,測定殘余酶活,以探究熱穩(wěn)定性;將未進行熱處理的酶液作為對照,定義其相對酶活性為100%.
1.2.6 酶活性的測定 測定Ap的活性參考文獻[7]中的酶活性測定法.
Ap肽鏈由403個氨基酸殘基組成,1~20氨基酸殘基序列是信號肽,21~121氨基酸殘基序列是前導肽,122~403氨基酸殘基序列是成熟肽,該酶是K型胞外蛋白酶.Ap的3-D結(jié)構(gòu)未見報道,Ap成熟肽與PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中3f7o.1.A(來源于Paecilomyceslilacinus)的同源性高達53.79%[9],根據(jù)同源性達到30%以上就可建模的理論,Ap以3f7o.1.A為3-D結(jié)構(gòu)模板,采用Ramachandran對主鏈ψ和φ角的合理性分析,結(jié)果表明模擬的Ap結(jié)構(gòu)合理(圖1).預(yù)測Ap的3-D結(jié)構(gòu)是其肽鏈124~402序列,便于下文敘述,以該結(jié)構(gòu)的第1個氨基酸殘基序號(Ap肽鏈中124位點氨基酸殘基)定義為1,余下序號以此類推.由圖1可見,Ap為單體酶,包括7個α螺旋、2個310-螺旋和15個β折疊,活性位點(催化三聯(lián)體)分別是D39/H70/S226.在3F7O.1中有1個Ca2+結(jié)合,結(jié)合殘基分別為Glu177、Val180、Leu201主鏈中的羰基氧,以及T182側(cè)鏈基團O1和D203側(cè)鏈基團的O2.Ap和3f7o.1.A的Ca2+結(jié)合空間結(jié)構(gòu),與圖2相比可知,在Ap中與Ca2+結(jié)合的殘基為A174、A177、V198、T179和D200,T179和D200位點的氨基酸殘基非常保守,由于T和D的側(cè)鏈O基團對Ca2+結(jié)合作用尤為重要.在模板3F7O.1中具有5個C殘基,其中4個C殘基(即C126-C36和C181-C253)之間分別形成了2對二硫鍵;而Ap中無C殘基,無二硫鍵形成.
圖1 Ap的3-D結(jié)構(gòu)模型
Fig.1 3-D structure model of Ap
圖2 Ap(黑色)和3f7o.1.A(紅色)中Ca2+結(jié)合位點的對比分析
Fig.2 Comparative analysis of the Ca2+binding sites between Ap (black) and 3f7o.1.A (red)
利用Disulfide by Design軟件預(yù)測Ap中可能形成二硫鍵的氨基酸殘基共56對(表2),結(jié)合模板3f7o.1中二硫鍵的形成情況,Ap中最有可能形成二硫鍵的氨基酸殘基為34~123和78~252.對該4個殘基進行突變,獲得Y34C-R123C、L178C-T252C、Y34C-R123C/L178C-T252C共3個突變基因,測序確認突變成功.
據(jù)2.1中Ap結(jié)構(gòu)分析,Ap的2個殘基T179和D200的側(cè)鏈基團O與Ca2+結(jié)合;將該2個殘基分別突變?yōu)闊o側(cè)鏈基團的G殘基,共獲得3個突變基因,即T179G、D200G、以及T179G/D200G的突變基因,測序確認突變成功.
表2 運用Disulfide by Design軟件預(yù)測在Ap形成二硫鍵的氨基酸殘基對Table 2 Predictions of amino acid residue pairs forming disulfide bonds in Ap using Disulfide by Design software
Y34C-R123C、L178C-T252C突變型均能在重組工程菌株中成功表達,分泌到發(fā)酵液中;突變型與野生型的發(fā)酵液中的酶活性差異不顯著,這表明增加1個二硫鍵對Ap表達不影響.
Y34C-R123C/L178C-T252C突變型不能在重組工程菌株中成功表達,這可能與Ap的折疊過程相關(guān).由于蛋白質(zhì)在成熟折疊過程中,一級肽鏈結(jié)構(gòu)中相距越近的半胱氨酸殘基間,越易形成巰基組合的分子異構(gòu)體,這種異構(gòu)體又促進蛋白質(zhì)的進一步折疊,但該異構(gòu)體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定;當?shù)鞍踪|(zhì)再折疊后,構(gòu)象有序性獲得加強,致使巰基組合解開,僅有接近天然構(gòu)象的柔性巰基才能靠近,形成正常天然的二硫鍵,再促使蛋白質(zhì)的正確折疊,形成穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)[11-12].Y34C-R123C、L178C-T252C突變型均能表達,但是Y34C-R123C/L178C-T252C突變型不能表達,這可能是由于R123C和L178C殘基在一級結(jié)構(gòu)上相距較近,形成了錯誤的巰基異構(gòu)體,但野生型Ap中沒有二硫鍵,導致該巰基結(jié)合不能斷裂,致使Ap不能進行進一步的正確折疊,導致降解不能被成功表達.
M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準物;1:發(fā)酵上清液;2:鎳柱親和層析洗脫液;3:凝膠層析洗脫液.圖3 重組Ap的電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant Ap
分別將野生型Ap、Y34C-R123C和L178C-T252C突變型從發(fā)酵液中鹽析沉淀出,鎳柱親和層析、Sephadex G-75的分子篩層析后,獲得電泳級純度(圖3).
對野生型、Y34C-R123C和L178C-T252C突變型Ap的反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性進行比較探究.由圖4可知,3種酶雖然最適反應(yīng)溫度均為45 ℃,但Y34C-R123C突變型在50 ℃和55 ℃的反應(yīng)溫度下的相對酶活均高于野生型和L178C-T252C突變型;進一步對熱穩(wěn)定性比較,圖5可見,Y34C-R123C突變型在40 ℃處理100 min后殘余酶活(約56%)高于野生型(約34%)的殘余酶活性22%,通過反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性結(jié)果可見,Y34C-R123C突變型結(jié)構(gòu)中,形成了二硫鍵結(jié)構(gòu)提高了Ap的穩(wěn)定性;由圖1可見R123殘基位于連接二級結(jié)構(gòu)的LOOP環(huán)上,Y34處于Ap的無規(guī)則卷曲區(qū),通過C34-C123形成的二硫鍵增強了Ap該無規(guī)則卷曲區(qū)域結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,從而提高了Ap的耐熱性;該結(jié)果與楊倩等報道相似,即對米根霉的α-淀粉酶,采用增加氫鍵來提高酶中無規(guī)則卷曲構(gòu)象不穩(wěn)定區(qū)域的穩(wěn)定性后,提高了該酶的熱穩(wěn)定性[13].
L178C-T252C突變型在反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性方面都表現(xiàn)出弱于野生型.這可能由于L178和T252殘基分別在相對較為剛性的β折疊和α螺旋上,C178-C252間形成了二硫鍵,對β折疊和α螺旋結(jié)構(gòu)有一定的影響,導致突變型Ap的熱穩(wěn)定性降低.
3個Ca2+結(jié)合殘基的突變型基因(T179G、D200G、T179G/D200G)在工程菌株的發(fā)酵液中都未檢測酶活性,并且發(fā)酵液的SDS-PAGE電泳圖譜中也未有相應(yīng)的重組蛋白酶條帶,這表明3種突變型的Ap均不能在重組畢赤酵母菌株中成功表達.該結(jié)果與2.1中Ap結(jié)構(gòu)分析一致,這表明T179、D200殘基的側(cè)鏈O對Ca2+的結(jié)合至關(guān)重要.
圖4 重組Ap野生型和突變型的最適反應(yīng)溫度
Fig.4 Effects of different reaction temperature on the
recombinant Ap and mutants
“—”野生型;“┄”Y34C-R123C突變型;“…”L178C-T252C突變型.
圖5 重組Ap野生型和突變型的熱穩(wěn)定性
Fig.5 Thermostability of the recombinant Ap and mutants
金屬離子對酶活性質(zhì)的影響研究較受大家的關(guān)注,有研究表明[14-15]位于α-淀粉酶BLA的結(jié)構(gòu)域A、C之間的鈣離子結(jié)合,對維持BLA穩(wěn)定性非常重要.在α-淀粉酶中增加Zn2+結(jié)合位點,得到了在80 ℃情況下耐熱穩(wěn)定性提高4.5倍的突變型[16].這些研究表明金屬離子對酶的影響重要性,在本研究中,對于野生型Ap在EDTA金屬螯合劑存在的情況下,酶活性下降約15.2%,這表明在EDTA存在下Ca2+被奪走,對Ap酶結(jié)構(gòu)有影響,導致酶活性下降.突變型T179G、D200G、T179G/D200G不能結(jié)合Ca2+,導致Ap局部空間結(jié)構(gòu)不能穩(wěn)定,致使整個Ap不能正確的折疊,不能形成正確成熟的Ap結(jié)構(gòu),不能成功表達.這表明T179、D200是Ap中的Ca2+高親和力結(jié)合位點,對Ap的正確折疊和維持成熟穩(wěn)定的活性起到非常重要的作用.
對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性影響的因素較多,如氨基酸殘基的疏水作用、鹽鍵、氫鍵和二硫鍵等,不同結(jié)構(gòu)類型的蛋白質(zhì)受到具體因素的影響程度具有差異[13].在本試驗中,采用理性設(shè)計在Ap酶中引入二硫鍵的突變型,獲得熱穩(wěn)定性增強的Y34C-R123C突變型,也獲得穩(wěn)定性相對減弱的L178C-T252C突變型,以及不能成功表達的Y34C-R123C/L178C-T252C突變型.結(jié)果表明,在Ap酶中增加二硫鍵以提高其穩(wěn)定性的方法可行,對于確定增加二硫鍵的具體位點非常關(guān)鍵,應(yīng)盡量選擇酶結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲等構(gòu)象相對不穩(wěn)定的區(qū)域進行設(shè)計.
對Ap酶中預(yù)測可能參與Ca2+結(jié)合的氨基酸殘基進行突變,將含有側(cè)鏈基團O的氨基酸殘基突變?yōu)闊o側(cè)鏈基團的G,這導致突變型T179G、D200G、T179G/D200G不能成功表達,這表明T179和D200殘基對Ca2+結(jié)合到Ap中至關(guān)重要,同時Ca2+對Ap的正確折疊、形成成熟的活性酶具有重要作用.本試驗對Ap類蛋白酶及其他酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究提供了依據(jù).