王 鈞,汪雪峰

(1.鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

“衛(wèi)生假說”認(rèn)為，目前發(fā)達(dá)國家自身免疫或過敏性疾病的增加與環(huán)境衛(wèi)生條件的改善、抗生素的大量使用等導(dǎo)致其幼年時(shí)獲感染的概率下降密切相關(guān)[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，病原體感染特別是蠕蟲感染與自身免疫或過敏性疾病存在相反的關(guān)系，蠕蟲感染的流行區(qū)，自身免疫或過敏性疾病的發(fā)病率較低，反之亦然[2]。從史前木乃伊中發(fā)現(xiàn)的蠕蟲證實(shí)了蠕蟲感染參與人類的整個(gè)進(jìn)化過程[3-4]。與人類共進(jìn)化的蠕蟲可通過抑制宿主的免疫反應(yīng)達(dá)到長期寄生的目的，為自身免疫或哮喘等炎癥性疾病的治療提供了新的研究方向。近年來研究發(fā)現(xiàn)，蠕蟲感染或蠕蟲來源的免疫調(diào)節(jié)分子可預(yù)防或治療多種自身免疫或過敏性疾病的模型小鼠，如1型糖尿病、炎性腸病、哮喘等[5]。本研究前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲來源多肽SJMHE1可抑制小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)[6-8]，減輕膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥反應(yīng)[9]。因此，具有抗炎效應(yīng)的此日本血吸蟲來源多肽具有廣泛的臨床應(yīng)用前景，本研究主要檢測該小分子多肽注射到關(guān)節(jié)炎小鼠后可能的毒副反應(yīng)，為今后的臨床轉(zhuǎn)化提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 60只6～8周齡的雄性DBA/1小鼠購自南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號：SCXK(蘇)2010-0001。小鼠均在江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，無特定病原體級管理。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵照江蘇大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會指南及協(xié)議。SJMHE1、卵清蛋白323-339多肽(ovalbumin,OVA323-339)購自中國淘普生物公司；牛 Ⅱ 型膠原購自美國BD Bioscience公司；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑購自美國Sigma公司；結(jié)核分枝桿菌購自美國Difco公司。

1.2方法

1.2.1建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠(collagen-induced arthritis，CIA)模型 參照文獻(xiàn)[9]的研究，200 μg牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑等量混合，制成乳化劑，在0、21 d尾根部皮下免疫DBA/1小鼠，共免疫2次。完全弗氏佐劑由不完全弗氏佐劑中加4 mg/mL的結(jié)核分枝桿菌H37RA配制，并經(jīng)關(guān)節(jié)炎癥的臨床評分及組織學(xué)鑒定，驗(yàn)證CIA小鼠的構(gòu)建成功。

1.2.2CIA的臨床評定 每天監(jiān)測小鼠關(guān)節(jié)炎的癥狀，觀察到一個(gè)腳爪出現(xiàn)紅斑或腫脹，視為關(guān)節(jié)炎開始發(fā)病，并進(jìn)行臨床評分，關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度分0～3個(gè)等級：0級為無改變，1級為輕微腫脹和(或)紅斑，2級為中度腫脹和紅斑，3級為顯著的腫脹和紅斑；根據(jù)4個(gè)腳爪的炎癥狀況，每只小鼠最高評分為12分[9]。

1.2.3組織學(xué)鑒定 在牛Ⅱ型膠原免疫的第55天，分離各治療組小鼠的膝關(guān)節(jié)，10%的甲醛固定24 h后，用5%的三氯乙酸脫鈣7 d，然后脫水，石蠟包埋，制成3～4 μm的切片，蘇木精-伊紅染色后顯微鏡檢查組織學(xué)改變。

1.2.4SJMHE1處理CIA小鼠 60只小鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為Naive組、SJMHE1組、OVA323-339組、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)組及 CIA組，每組12只；將10 μg SJMHE1、10 μg OVA323-339、PBS與完全弗氏佐劑等量混合，制成乳化劑，尾脊部皮下注射小鼠，注射劑量100 μL/只；在牛Ⅱ型膠原免疫的第7天進(jìn)行小鼠皮下免疫，每隔14天免疫一次，共注射3次。

1.2.5小鼠血細(xì)胞、血清生化指標(biāo)測定 在SJMHE1皮下免疫8周后，小鼠眶內(nèi)眥取血進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血清生化指標(biāo)檢測，包括小鼠肝臟功能指標(biāo)(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)和腎臟功能指標(biāo)(尿素氮、尿肌酐)，采用日本奧林巴斯Au2700全自動(dòng)生化儀進(jìn)行檢測。

1.2.6小鼠組織病理切片觀察 分離各處理組小鼠肝臟、腎臟、肺臟、心臟，隨即放入裝有10%甲醛固定液的標(biāo)本瓶中浸泡固定48 h后做病理組織學(xué)檢查，蘇木精-伊紅染色，光鏡觀察各個(gè)器官組織形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié) 果

2.1CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥的病理改變 OVA323-339組、PBS組和CIA組小鼠的腳爪病理出理大量炎癥細(xì)胞浸潤，滑膜增生，關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，有血管翳，軟骨有侵蝕和破壞；但SJMHE1處理小鼠關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞的浸潤及軟骨破壞最輕，與Naive組小鼠相同，其關(guān)節(jié)滑膜完整，滑膜細(xì)胞1～2層，排列整齊，軟骨完整。見圖1。

Naive:正常對照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸鹽緩沖液；CIA：膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎

2.2SJMHE1處理對白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響 Naive組、SJMHE1組、OVA323-339組、PBS組、CIA組白細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(1.85±0.07)×109/L、(1.95±0.21)×109/L、(4.12±1.13)×109/L、(3.70±1.11)×109/L、(5.10±1.27)×109/L，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.320,P<0.01)，OVA323-339組、PBS組、CIA組小鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于Naive組(P<0.05)，但SJMHE1組白細(xì)胞計(jì)數(shù)與Naive組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3SJMHE1處理對小鼠血清生化指標(biāo)的影響 各組小鼠ALT、AST、BUN、Cr比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

2.4SJMHE1處理對主要臟器的影響 Naive組、SJMHE1組、OVA323-339組、PBS組及CIA組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常(圖2)；各組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)正常，可見泌尿小管、少量血管神經(jīng)等構(gòu)成的腎間質(zhì)，腎小管上皮細(xì)胞完整(圖3)；各組小鼠肺組織中肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔和支氣管干凈，有少量紅細(xì)胞(圖4)；各組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，心肌纖維細(xì)長，心肌纖維間有少量組織(圖5)；SJMHE1處理未見小鼠肝臟、腎臟、肺臟、心臟出現(xiàn)異常。

表1 各組小鼠血清生化指標(biāo)比較

Naive:正常對照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸鹽緩沖液；CIA：膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎

Naive:正常對照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸鹽緩沖液；CIA：膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎

Naive:正常對照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸鹽緩沖液；CIA：膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎

Naive:正常對照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸鹽緩沖液；CIA：膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎

Naive:正常對照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸鹽緩沖液；CIA：膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎

3 討 論

蠕蟲感染或蠕蟲來源的免疫調(diào)節(jié)分子可抑制多種自身免疫、過敏等炎癥反應(yīng)。如曼氏血吸蟲、蛔蟲的磷脂酰絲氨酸[10]、魏氏棘唇線蟲的排泄-分泌物ES-62等均可以通過Toll樣受體抑制血友病A、關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、哮喘等[11-14]。但目前大多數(shù)已鑒定出的蠕蟲免疫調(diào)節(jié)分子多為蛋白大分子、糖脂、糖蛋白混合物，具有潛在的免疫原性副反應(yīng)[15-16]。血吸蟲感染也可加劇過敏性疾病的發(fā)病，除血吸蟲感染可誘導(dǎo)Th2細(xì)胞極化反應(yīng)外，血吸蟲本身含有的過敏原也可加劇過敏性疾病的發(fā)病[17-18]。因而，為了減少蠕蟲分子抗炎治療帶來的不良反應(yīng)，一些研究者開始尋求蠕蟲分子的小分子類似物，如來自ES-62的小分子類似物已被證明可抑制哮喘和關(guān)節(jié)炎等[14,19-20]。與上述尋求蠕蟲小分子類似，本課題組致力于尋求蠕蟲抗原的小分子多肽，期待其具有抗炎效應(yīng)的同時(shí)，提高治療過程中的安全性。

另外，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性炎癥性疾病，影響全球約1%的人口，我國發(fā)病率為0.3～0.5%，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的致殘率較高，未經(jīng)治療的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者2～3年致殘率高達(dá)70%[21]，由此造成喪失勞動(dòng)能力的人群高達(dá)千余萬，已成為一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要病理特征為滑膜增生，炎癥細(xì)胞浸潤、血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下破壞等。目前類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床治療仍以非甾體抗炎藥物和慢作用抗風(fēng)濕藥物為主，糖皮質(zhì)激素和細(xì)胞毒免疫抑制劑也較常用，這些藥物均有一定療效，但由于不良反應(yīng)較大，患者難以長期服用。因此，急需尋求新的特異性作用靶點(diǎn)或新的干預(yù)手段對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行治療，開發(fā)毒性小且能有效治療的藥物不僅具有重要的社會效益，還將產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)效益。

目前關(guān)于蠕蟲感染或蠕蟲產(chǎn)物治療關(guān)節(jié)炎的報(bào)道也較多，如日本血吸蟲感染可抑制小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，減輕關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀，減少滑膜增生，減少滑膜炎癥細(xì)胞的浸潤，減少血管翳的形成及破骨細(xì)胞活化，減少關(guān)節(jié)破壞[22]。旋毛蟲感染的小鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率明顯降低；旋毛蟲感染可經(jīng)程序性細(xì)胞死亡受體1介導(dǎo)，減少致炎性Th1/Th17細(xì)胞反應(yīng)，顯著減輕小鼠關(guān)節(jié)炎的病理改變[23]；豬蛔蟲的提取物口服或皮下注射，也可抑制小鼠酵母聚糖和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，減少軟骨增生及破壞[24]。因?yàn)槿湎x感染易引起較多的不良反應(yīng)，更多的研究者也在關(guān)注蠕蟲分子對關(guān)節(jié)炎的抑制效應(yīng)，其中研究最多、最廣泛是魏氏棘唇線蟲的ES-62，ES-62可通過調(diào)節(jié)腸道微生物和腸黏膜屏障的完整[11]，抑制Th17和γδT細(xì)胞依賴的白細(xì)胞介素-17產(chǎn)生，抑制小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[25]；由于ES-62為大分子，為了減少大分子可能的免疫原性不良反應(yīng)，其小分子類似物也被證明可抑制炎癥性關(guān)節(jié)炎和破骨細(xì)胞生成[19]。因?yàn)槟壳吧形窗l(fā)現(xiàn)蠕蟲來源多肽在關(guān)節(jié)炎小鼠中的毒副反應(yīng)檢測，本研究對關(guān)節(jié)炎小鼠的安全性檢測參照藥物或疫苗的檢測指標(biāo)及方法[26-27]。本研究結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)炎小鼠的腳爪病理出理大量炎癥細(xì)胞的浸潤，滑膜增生，關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，有血管翳，軟骨有侵蝕和破壞，說明關(guān)節(jié)炎小鼠模型構(gòu)建成功，但SJMHE1處理的小鼠關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞的浸潤及軟骨破壞最輕，與Naive組小鼠類似，關(guān)節(jié)滑膜仍保持完整。該結(jié)果與小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果一致，與OVA323-339、PBS及CIA組小鼠相比，小鼠皮下注射血吸蟲多肽SJMHE1，可明顯減少外周血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)，表明SJMHE1可抑制關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥反應(yīng)；與Naive組小鼠相比，SJMHE1處理不會引起肝、腎主要生化酶學(xué)的升高，表明SJMHE1處理不會引起明顯的肝、腎功能損害；同時(shí)，不會引起小鼠主要臟器肝臟、腎臟、肺臟、心臟組織的病理學(xué)改變。全程無小鼠死亡，未見小鼠攝食減少、體重下降等不良反應(yīng)，表明該小分子多肽具有應(yīng)用的安全性，可為今后進(jìn)一步開展基于此小分子多肽的治療關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病的臨床前研究提供依據(jù)，也為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療提供新的靶點(diǎn)和依據(jù)。

綜上所述，日本血吸蟲來源多肽SJMHE1可抑制膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥反應(yīng)，但不影響小鼠的肝、腎功能，對小鼠肝臟、腎臟、肺臟、心臟組織無明顯影響，具有較好的生物安全性。