彭春媛，劉江勤

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院新生兒科，上海 201204；2.寧波市婦女兒童醫(yī)院新生兒科，浙江 寧波 315012)

關(guān)鍵字:早產(chǎn)兒腦損傷；谷胱甘肽；核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2；抗氧化應(yīng)激;抗氧化屏障

隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)的不斷發(fā)展，早產(chǎn)兒特別是極低出生體重兒的存活率大大提高。而早產(chǎn)兒腦損傷的發(fā)生也相應(yīng)增多，作為影響早產(chǎn)兒遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的主要原因，其主要病因包括缺氧缺血、感染、低血糖、機(jī)械通氣、高膽紅素血癥等[1]。造成早產(chǎn)兒腦損傷的機(jī)制包括興奮毒性損傷和自由基損傷，其中自由基包括活性氧(超氧陰離子、羥基自由基、過氧化氫等)和活性氮(一氧化氮及其衍生物)。當(dāng)自由基產(chǎn)生增加，抗氧化儲備快速消耗，細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)和DNA被氧化，產(chǎn)生一系列生理、病理反應(yīng)，即為氧化應(yīng)激。早產(chǎn)兒對氧化應(yīng)激特別敏感，常導(dǎo)致嚴(yán)重腦損傷。為抵抗氧化應(yīng)激損傷，機(jī)體在不斷進(jìn)化中形成了一系列防御屏障。其中，谷胱甘肽在正常條件下能清除氧自由基，可與毒性代謝產(chǎn)物直接反應(yīng)，或通過相關(guān)酶的作用將過氧化氫還原成水和氧，從而發(fā)揮抗氧化作用[2]。另外，谷胱甘肽也可作為一種金屬結(jié)合蛋白，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞正常代謝[3]?，F(xiàn)就谷胱甘肽的合成、代謝對早產(chǎn)兒腦損傷的影響予以綜述。

1 谷胱甘肽合成、代謝的主要相關(guān)酶

在谷胱甘肽的合成、代謝過程中，有幾種關(guān)鍵酶參與了其中。細(xì)胞膜上的谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate/cystine transporter，xCT)將胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，用于合成谷胱甘肽和含有半胱氨酸的蛋白。在細(xì)胞內(nèi)，谷氨酸-半胱氨酸連接酶(glutamate cysteine ligase，GCL)攝取胱氨酸合成谷胱甘肽，維持細(xì)胞的抗氧化能力。谷胱甘肽過氧化物酶將谷胱甘肽氧化成為氧化型谷胱甘肽，同時谷胱甘肽在過氧化氫酶的作用下將過氧化氫還原成為水。而氧化型谷胱甘肽在依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶1的作用下重新還原成為谷胱甘肽。谷胱甘肽的這個合成、代謝過程是機(jī)體重要的抗氧化屏障功能之一。

在谷胱甘肽的合成過程中，xCT的重要功能是將細(xì)胞外的胱氨酸轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞，用于合成谷胱甘肽，并將細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外，實現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，xCT在神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育過程中有重要作用，xCT部分失活的星形膠質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時失去增殖能力。在體外培養(yǎng)的未成熟神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)的xCT水平明顯低于成熟細(xì)胞，說明未成熟的神經(jīng)細(xì)胞相較成熟神經(jīng)細(xì)胞更易受到損傷[4]。xCT在神經(jīng)細(xì)胞上的表達(dá)差異較大，研究顯示小鼠神經(jīng)細(xì)胞xCT的催化亞單位在神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，但在星形膠質(zhì)細(xì)胞上不表達(dá)，若抑制xCT的表達(dá)會導(dǎo)致谷胱甘肽耗竭，神經(jīng)元退行性變和脫髓鞘，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被破壞[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠xCT主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，在神經(jīng)元不表達(dá)，通過上調(diào)細(xì)胞膜上的xCT表達(dá)能促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取胱氨酸，可提高谷胱甘肽的產(chǎn)量，從而使周圍神經(jīng)細(xì)胞具有抗氧化應(yīng)激能力[6]。砷處理的小膠質(zhì)細(xì)胞通過競爭性抑制xCT引起細(xì)胞外胱氨酸/谷氨酸不平衡，即培養(yǎng)液中的胱氨酸含量減少，谷氨酸含量增加，從而導(dǎo)致周圍不成熟神經(jīng)元細(xì)胞死亡，補(bǔ)充N-乙酰半胱氨酸能改善神經(jīng)元存活率[7]。以上證據(jù)表明，xCT在細(xì)胞的增殖、維持穩(wěn)態(tài)及促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)方面有重要作用。

GCL是谷胱甘肽合成的限速酶，由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基組成，通過該酶攝取胱氨酸合成谷胱甘肽，維持細(xì)胞抗氧化能力，可實現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用[8]。谷胱甘肽的合成由多種因素控制，包括GCL的水平、兩個亞基的比例、合成谷胱甘肽的底物L(fēng)-胱氨酸和細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平的負(fù)反饋對GCL的抑制[9]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，通過抑制大鼠GCL基因表達(dá)可導(dǎo)致線粒體內(nèi)谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)受損，線粒體功能障礙，神經(jīng)細(xì)胞減少[10]。神經(jīng)細(xì)胞缺乏GCL會導(dǎo)致谷胱甘肽產(chǎn)量顯著降低，進(jìn)而增加細(xì)胞對缺氧損傷的敏感性[11]。Pehar等[12]研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的GCL調(diào)節(jié)亞基，其總谷胱甘肽水平降低80%，從而使得對神經(jīng)元的保護(hù)作用減弱。也有研究顯示，當(dāng)GCL的活性持續(xù)下降時，谷胱甘肽水平也持續(xù)降低，但氧化性DNA損傷水平較高；GCL過度表達(dá)可顯著提高谷胱甘肽水平，抑制DNA氧化損傷，從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和生長[13]。GCL的基因存在多態(tài)性，并影響其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，特別是當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激時，這種基因的多態(tài)性會改變細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)胞容易受到氧化應(yīng)激損傷。因此，實驗室常用谷胱甘肽抑制劑抑制GCL的作用，從而減少谷胱甘肽合成，且谷胱甘肽缺乏的動物模型也常采用GCL基因敲除制作。另外，GCL在細(xì)胞發(fā)育成熟過程中也起關(guān)鍵作用，敲除GCL基因的小鼠胚胎不能發(fā)育成熟，細(xì)胞發(fā)生大量凋亡，但在培養(yǎng)基中加入谷胱甘肽或N-乙酰半胱氨酸可促進(jìn)胚球的發(fā)育。

2 核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子對抗氧化應(yīng)激的調(diào)控作用

核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)為堿性亮氨酸鋅基轉(zhuǎn)錄因子，其是外源性有毒物質(zhì)和氧化應(yīng)激的感受器，也是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)者。它介導(dǎo)啟動下游編碼抗氧化蛋白和解毒酶對抗氧化應(yīng)激的損害，這是一個重要的細(xì)胞防御機(jī)制。正常生理狀態(tài)下，Nrf2在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與抑制它的Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1結(jié)合，使Nrf2成為 E3泛素連接酶的適配底物，促進(jìn)Nrf2泛素化繼而被26S蛋白酶體降解。當(dāng)自由基、毒性物質(zhì)增多時，親電子物質(zhì)對Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1的半胱氨酸殘基進(jìn)行修飾，引起 Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1的構(gòu)象變化，進(jìn)而導(dǎo)致Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1解離，此時Nrf2穩(wěn)定性增加并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中與抗氧化特異基因啟動子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動解毒酶和抗氧化基因表達(dá)，這是Nrf2最普遍的活化方式，這一激活過程稱為Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件通路；另外，Nrf2還可以通過促分裂原活化的蛋白激酶、蛋白激酶C和磷脂酰肌醇-3-激酶等途徑磷酸化而間接激活。Nrf2調(diào)節(jié)許多細(xì)胞保護(hù)蛋白的表達(dá)，如xCT、GCL、血紅素氧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶1，這些酶參與調(diào)節(jié)谷胱甘肽的合成、代謝，有效阻斷由于谷胱甘肽缺乏、谷胱甘肽利用障礙等原因引起的神經(jīng)毒性作用，從而保護(hù)機(jī)體免受活性物質(zhì)及一些有毒物質(zhì)的侵害[14]。一項模擬腦缺血缺氧/復(fù)氧損傷的動物實驗顯示，抑制Nrf2降解，增強(qiáng)其與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合的活性，有利于大腦神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷后恢復(fù)[15]。在氧化應(yīng)激損傷時，作為Nrf2的激活劑特丁基對苯二酚通過提高谷胱甘肽水平、增加Nrf2的穩(wěn)定性及抑制Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1泛素化發(fā)揮其抗氧化功能，從而減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡[16-17]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)鈣上調(diào)谷胱甘肽水平起神經(jīng)保護(hù)作用就是通過Nrf-2介導(dǎo)實現(xiàn)，而敲除Nrf2基因這種保護(hù)作用將消除[18]。臨床上，激活Nrf2的藥物二甲酸富馬酸也是通過增加Nrf2的活性而具有間接延緩神經(jīng)元死亡的作用[19]。且Nrf2及其激活劑還可通過調(diào)節(jié)xCT的基因表達(dá)，具有神經(jīng)保護(hù)作用[20]。但缺乏xCT是否會減弱Nrf2誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用，尚需進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，微RNA(microRNA，miRNA)與Nrf2、抗氧化蛋白酶之間有密切聯(lián)系[21-22]。miRNA是一類存在于動植物體內(nèi)、大小為21～25nt的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA。在動物細(xì)胞中，大多數(shù)miRNA通過與靶基因的信使RNA 3′非翻譯區(qū)結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄后的翻譯，從而起到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。在一個miR-144過表達(dá)模型中，miR-144不僅使神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)氧自由基增加，細(xì)胞活性降低，谷胱甘肽和抗氧化酶活性降低，也使GCL催化亞基、GCL調(diào)節(jié)亞基、Nrf2表達(dá)減少[21]。有學(xué)者采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后左心室細(xì)胞內(nèi)的miR-27a、miR-28-3p和miR-34a表達(dá)水平高于其他器官，這些miRNA通過抑制Nrf2活性增加氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致心力衰竭[22]。以上研究說明，miRNA可以通過對Nrf2的負(fù)性調(diào)節(jié)使細(xì)胞抗氧化能力降低。也有研究者通過建立小鼠順鉑誘導(dǎo)的急性腎損害模型發(fā)現(xiàn)，miR140-5p直接作用于Nrf2的3′非翻譯區(qū)并起著積極調(diào)節(jié)Nrf2表達(dá)的作用，且依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶1、血紅素氧化酶的水平也明顯提高，因而細(xì)胞的抗氧化能力顯著增強(qiáng)[23]?？梢姡瑢iRNA調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的深入研究，很可能為將來治療感染、腫瘤和自身免疫系統(tǒng)疾病提供一種全新的治療手段。

3 星形膠質(zhì)細(xì)胞在抗氧化屏障中的作用

星形膠質(zhì)細(xì)胞在抗氧化應(yīng)激過程中有非常重要的作用，其功能受損是神經(jīng)元及其他神經(jīng)細(xì)胞原發(fā)性和繼發(fā)性受損的重要原因[24]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是人類大腦內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞，不同程度的神經(jīng)損傷會激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，改變其形態(tài)及功能蛋白的表達(dá)，對周圍神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生影響，形成膠質(zhì)瘢痕。在神經(jīng)損傷的早期階段，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過多種方式促進(jìn)神經(jīng)元的存活，但隨著損傷的進(jìn)展，它又會抑制神經(jīng)元的再生。

星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)損傷中的一個重要保護(hù)機(jī)制為其通過合成谷胱甘肽，清除損傷產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物(氧自由基、鐵和氧化的脂質(zhì)等)，從而抑制氧化應(yīng)激損傷[2]。這一解毒過程需要星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有足夠水平的谷胱甘肽，不同解毒過程在一定條件下相互干擾甚至相互競爭谷胱甘肽；星形膠質(zhì)細(xì)胞中谷胱甘肽的合成、循環(huán)、輸出受損可能影響谷胱甘肽依賴的解毒過程，進(jìn)而對星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生損害，同時對其他腦細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用也減弱[25]。研究表明，當(dāng)神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時，其谷胱甘肽在12和24 h分別增加1.5倍和5倍，可阻斷魚藤酮和百草枯引起的胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元死亡和損傷[26]。此外，共培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞還可通過食欲肽-A受體1/蛋白激酶Cα/胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體途徑提高谷胱甘肽水平，增強(qiáng)抵抗缺氧低糖損傷的能力[27]。另有研究表明，磷酸腺苷激活的蛋白激酶能選擇性調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GCL調(diào)節(jié)亞基的表達(dá)，促進(jìn)谷胱甘肽合成，從而保護(hù)神經(jīng)元[8]。且星形膠質(zhì)細(xì)胞對新生兒的腦保護(hù)作用，還表現(xiàn)在它對谷氨酸的攝取，減輕谷氨酸對新生兒腦興奮性的毒性作用；在丙酮酸羧化酶的作用下，星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠合成神經(jīng)遞質(zhì)，促進(jìn)神經(jīng)元的正常發(fā)育[28]?？梢?，星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦合成谷胱甘肽的主要細(xì)胞，它對周圍腦細(xì)胞起重要的保護(hù)作用。但目前對未成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞Nrf-2調(diào)節(jié)谷胱甘肽合成、代謝過程及其對損傷的反應(yīng)和神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究相對較少，需進(jìn)一步探索。

4 谷胱甘肽水平對早產(chǎn)兒大腦的影響

早產(chǎn)兒大腦的谷胱甘肽水平是否與足月兒或成人大腦有差別，目前尚沒有明確的結(jié)論。一項較大樣本的尸檢顯示，新生兒大腦的谷胱甘肽水平與老年人相似，但成年人的谷胱甘肽水平較高，推測原因為成年人接受較多的氧化應(yīng)激，從而維持較高水平的谷胱甘肽[29]。一項研究通過監(jiān)測不同孕周母血和出生時臍血中的氧化產(chǎn)物、谷胱甘肽過氧化物酶等發(fā)現(xiàn)，氧化酶和抗氧化酶呈負(fù)相關(guān)，故推斷谷胱甘肽參與的抗氧化系統(tǒng)保證了妊娠的維持[30]。在早產(chǎn)和受損的新生大鼠大腦中谷胱甘肽水平低于正常足月大鼠，且細(xì)胞凋亡也更嚴(yán)重[31]。這可能由于谷胱甘肽的代謝受多個代謝酶的影響，這些代謝酶水平低下，導(dǎo)致谷胱甘肽的合成功能不成熟，且在受到氧化應(yīng)激時維持還原狀態(tài)的能力也有限。因此，當(dāng)大腦皮質(zhì)遭受缺氧損傷時，谷胱甘肽的儲備顯著減少，腦組織內(nèi)氧化型谷胱甘肽、脂質(zhì)過氧化物水平升高，而給予新生豬N-乙酰半胱氨酸(谷胱甘肽合成前體)可顯著降低新生豬大腦皮質(zhì)的炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素-1β及核因子κB水平，恢復(fù)組織谷胱甘肽儲備，起神經(jīng)保護(hù)作用[32]。以上研究表明，相較于成熟個體，早產(chǎn)個體大腦對谷胱甘肽的合成、代謝、利用能力較弱，而通過提高谷胱甘肽合成代謝相關(guān)酶活性或提供N-乙酰半胱氨酸可改善谷胱甘肽在抗氧化應(yīng)激中的作用。

5 小 結(jié)

目前，許多國內(nèi)外學(xué)者致力于研究早產(chǎn)兒腦損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、預(yù)防治療措施，以期改善腦損傷早產(chǎn)兒的遠(yuǎn)期預(yù)后。但越來越多的證據(jù)表明，早產(chǎn)兒大腦合成和調(diào)節(jié)谷胱甘肽的抗氧化屏障還不成熟，這可能是早產(chǎn)兒易發(fā)生腦損傷一個重要機(jī)制[7，33-34]。而Nrf-2介導(dǎo)的谷胱甘肽參與的抗氧化屏障對各種外來和內(nèi)在的應(yīng)激起重要的保護(hù)作用；星形膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞，它在腦細(xì)胞保護(hù)方面也起關(guān)鍵作用。相信隨著對谷胱甘肽合成、代謝過程的深入研究，其將對早產(chǎn)兒腦損傷的防治工作產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。