劉小莉 圖爾蓀阿依·圖爾貢， 王 帆 潘建林 付龍龍 努爾古麗·熱合曼王 榮 周劍忠*

（1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 南京210014 2 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所 南京210017 3 新疆師范大學(xué) 烏魯木齊830054 4 泰興市江之韻科技發(fā)展有限公司 江蘇泰州225400）

納米粒子是指尺寸在1～100 nm 間的粒子，處在原子簇和宏觀物體交界的過度區(qū)域[1]。納米保鮮技術(shù)是采用納米包裝材料或納米保鮮劑對(duì)食品進(jìn)行保鮮處理的一種技術(shù)，因金屬銀的殺菌能力最強(qiáng)，故含銀粒子（離子）抗菌劑是目前研究最多的無機(jī)抗菌劑[2]。納米銀作為無機(jī)抗菌劑在食品貯藏保鮮中有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值與應(yīng)用前景。

我國是水產(chǎn)品生產(chǎn)與消費(fèi)大國，水產(chǎn)品的收獲期相對(duì)集中，攜帶大量的細(xì)菌，由于其營養(yǎng)成分不同于其它食品，即碳水化合物含量非常少，而蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量非常豐富，這些特性決定了水產(chǎn)品腐敗的特征性腐敗微生物不同于其它食品[3]。很多研究對(duì)水產(chǎn)品的腐敗微生物生態(tài)進(jìn)行了分析，認(rèn)為熒光假單胞菌、腐敗希瓦菌、發(fā)光細(xì)菌等革蘭氏陰性菌是導(dǎo)致水產(chǎn)腐敗的重要的腐敗細(xì)菌，對(duì)水產(chǎn)品的安全構(gòu)成生物危害[4-6]。目前我國水產(chǎn)品防腐保鮮體系相對(duì)滯后，現(xiàn)有的生物或化學(xué)合成保鮮劑，如Nisin、山梨酸鉀、苯甲酸酸鈉等主要對(duì)革蘭氏陽性菌有很好的抑制效果[7]，而對(duì)革蘭氏陰性菌作用很小，限制了水產(chǎn)加工行業(yè)的發(fā)展。

本研究以分離自腐敗淡水魚中的優(yōu)勢腐敗菌作為抑菌實(shí)驗(yàn)指示菌，采用生物合成法制備的納米銀粒子，研究納米銀對(duì)水產(chǎn)品腐敗菌，尤其是革蘭氏陰性菌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

革蘭氏陰性抑菌實(shí)驗(yàn)指示菌：普羅威登斯菌（Providencia vermicola）XLX5、變形桿菌（Proteus sp.）BY-2、摩根氏菌（Morganella sp.）JY-1、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）VP1，由自然腐敗的淡水魚中分離獲得，于20%甘油管中-70 ℃保存。山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸鏈球菌素為市售食品級(jí)添加劑，購于河南久易生物科技有限公司。鉀（K）測定盒，購于南京建成生物工程研究所。其它試劑為分析純級(jí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 納米銀的制備 采用生物還原法制備納米銀[8]。反應(yīng)完成后，將合成的納米銀溶液在12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min。棄上清，對(duì)納米銀顆粒沉淀重復(fù)水洗2 次，離心收集沉淀，凍干后收集納米銀粉末。以純水溶解至質(zhì)量濃度5 mg/mL，備用。

1.2.2 指示菌的培養(yǎng) 配制肉湯培養(yǎng)基（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂12 g，水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH7.0～7.2），121 ℃高壓滅菌15 min，備用。液體活化采用不添加瓊脂的液體肉湯培養(yǎng)液。-70 ℃保藏的菌株甘油管于室溫下融化，吸取100 μL 保存菌種，接種于5 mL 肉湯液體培養(yǎng)基，37℃、120 r/min 培養(yǎng)24 h。

1.2.3 體外抑菌試驗(yàn) 采用平板孔阱擴(kuò)散法研究納米銀的抗菌活性[9]。將活化好的試驗(yàn)指示菌種用冷卻的肉湯培養(yǎng)基稀釋至106CFU/mL 以上，倒平板。待培養(yǎng)基冷凝后，用直徑7 mm 的打孔器于平板上均勻打出3 個(gè)孔，吸取納米銀溶液50 μL 注入孔中，37 ℃下分別培養(yǎng)24 h 后測量抑菌圈大小，計(jì)算平均值。另外，采用山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸鏈球菌素，以無菌蒸餾水為溶劑，配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的溶液，作為陽性對(duì)照。

1.2.4 最低抑制濃度的測定 采用微孔板法測定納米銀溶液的最低抑制濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）[10]。將1.2.1 節(jié)中配制的納米銀用倍半稀釋法配成梯度濃度的溶液。取96 微孔板，每孔中加入100 μL 菌含量約106CFU/mL 的含菌肉湯培養(yǎng)基液及100 μL 不同濃度梯度的納米銀溶液，對(duì)照組為無菌水。37 ℃下培養(yǎng)24 h，于波長600 nm 處測定各孔吸光度值。微孔溶液澄清的最小濃度作為MIC。

1.2.5 細(xì)菌胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)的泄漏試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期指示菌，5 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，用0.75%生理鹽水洗滌3 次，并用生理鹽水稀釋至菌液最終濃度為4.0×107CFU/mL，配制2 MIC 和4 MIC 濃度的納米銀溶液，將納米銀溶液和指菌液混合，使納米銀溶液終濃度為MIC 和2 MIC，37 ℃恒溫孵育，每隔2 h 取樣離心，取上清液于260 nm 處測定其吸光值，表征胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)的泄漏量。

1.2.6 K+離子泄漏試驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長期的指示菌菌液離心收集菌體，用生理鹽水重懸菌體，加入納米銀溶液，終濃度分別為2 MIC 和MIC，菌液濃度為2.0×107CFU/mL，以去離子水作對(duì)照，37 ℃孵育24 h，每隔2 h 取樣離心。取上清液測定不同濃度和不同作用時(shí)間條件下納米銀溶液對(duì)指示菌細(xì)胞中K+離子泄露的影響。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性和最低抑制濃度

配制相同濃度的納米銀、山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸鏈球菌素，采用平板孔阱擴(kuò)散法研究體外抗菌活性，結(jié)果見表1。市售的3 種保鮮劑對(duì)4 種革蘭氏陰性水產(chǎn)腐敗菌沒有抑制作用，而納米銀粒子對(duì)4 種菌都有良好的抑制效果，其中變形桿菌BY-2 對(duì)納米銀的敏感性最強(qiáng)，抑菌圈（19.38±0.40）mm，其次為副溶血性弧菌、摩根氏菌和普羅威登斯菌。進(jìn)一步測定納米銀對(duì)4 種腐敗菌的最低抑制濃度（表2），最低抑制濃度的結(jié)果驗(yàn)證了體外平板抑菌試驗(yàn)的結(jié)果。納米銀對(duì)變形桿菌BY-2 的最低抑制質(zhì)量濃度為0.3125 mg/mL，副溶血性弧菌和摩根氏菌為0.6250 mg/mL，最不敏感的普羅威登斯菌為1.250 mg/mL。天然防腐劑乳酸鏈球菌素可有效抑制革蘭氏陽性菌，而對(duì)革蘭氏陰性菌不起作用[11]。山梨酸鉀、雙乙酸鈉也是在全球范圍使用廣泛的化學(xué)防腐劑，抑菌譜相對(duì)較廣，然而很多研究發(fā)現(xiàn)對(duì)革蘭氏陰性菌的效果不顯著[12-13]。所選用的3 種防腐劑對(duì)從淡水魚中分離得到的4 種特征性革蘭氏陰性菌均沒有抑制作用，而納米銀表現(xiàn)出良好的廣譜抑菌活性。

2.2 細(xì)菌胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)的泄漏

細(xì)胞膜是細(xì)菌的保護(hù)屏障，當(dāng)細(xì)菌遇到強(qiáng)抑菌劑作用而破壞細(xì)胞膜時(shí)，菌體的保護(hù)屏障被打破，抗菌物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，和胞內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA 等發(fā)生作用，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)大量泄漏[14]。圖1顯示腐敗菌胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)的泄漏結(jié)果，對(duì)照組紫外物質(zhì)泄露很少，變化緩慢，而添加納米銀抑菌劑的菌懸液中紫外吸收物質(zhì)泄漏隨時(shí)間的延長逐漸升高，且不同指示菌的變化趨勢差異顯著，表明添加納米銀破壞了菌體細(xì)胞膜及其它質(zhì)膜，導(dǎo)致質(zhì)膜通透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)部的可溶性蛋白質(zhì)泄漏以及附著在質(zhì)膜上的蛋白進(jìn)入溶液中。普羅威登斯菌XLX5 在不同納米銀抑菌劑濃度作用下，0～14h 內(nèi)泄漏量沒有顯著差異，隨著時(shí)間的延長逐漸呈顯著差異。其它3 種指示菌對(duì)不同濃度的納米銀溶液較敏感，隨著納米銀濃度的增加，紫外物質(zhì)泄漏顯著增加，其中變形桿菌BY-2 的胞內(nèi)紫外物質(zhì)泄漏最快。

表1 不同保鮮劑的體外平板抑菌活性Table 1 Inhibitory activity of different preservatives against the tested bacteria

表2 納米銀對(duì)腐敗菌的最低抑制濃度Table 2 MIC of silver nanoparticles against the tested bacteria

圖1 不同指示菌在納米銀溶液作用下紫外物質(zhì)的泄漏Fig.1 UV-absorbing substances in the tested bacteria with silver nanoparticles

2.3 細(xì)胞內(nèi)鉀離子的外流

圖2顯示在納米銀溶液作用下不同指示菌菌懸液中鉀離子濃度的變化情況。細(xì)胞中的鉀離子有多種重要的生理功能，Na+-K+泵使細(xì)胞內(nèi)、外的鈉離子和鉀離子維持一定水平，維持細(xì)胞滲透壓，保持細(xì)胞的靜息電位，也能使細(xì)胞膜內(nèi)、外形成一定電勢梯度，為物質(zhì)跨膜運(yùn)輸提供能量。納米銀的作用使細(xì)胞膜的通透性被破壞，菌體細(xì)胞內(nèi)部的鉀離子外泄，擾亂了細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，菌體死亡，且隨著納米銀濃度的增加而增加。謝海偉等[15]研究化學(xué)合成抗菌肽對(duì)致病性大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響，發(fā)現(xiàn)作用20～30 min，K+泄漏急劇上升；40～50 min，趨向最大泄漏量。本研究中不同指示菌均在10～12 h 鉀離子外泄呈急劇上升趨勢，表明納米銀在抑菌過程中發(fā)揮緩釋作用。

圖2 不同指示菌在納米銀溶液作用下鉀離子的泄漏Fig.2 K+ ion leakage in the tested bacteria with silver nanoparticles

3 結(jié)論

抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，與現(xiàn)有的常用商品化防腐劑相比，納米銀表現(xiàn)出良好的廣譜抑菌活性，對(duì)本研究所選4 種革蘭氏陰性水產(chǎn)腐敗菌的生長有顯著的抑制效果，最低抑制質(zhì)量濃度為0.3125～1.250 mg/mL，而3 種市售防腐劑均無抑制活性。研究發(fā)現(xiàn)納米銀作用于腐敗菌能破壞菌體細(xì)胞膜，使胞內(nèi)蛋白質(zhì)等紫外吸收物質(zhì)及鉀離子溶出，表現(xiàn)出良好的緩釋性能，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。