吳豪杰 鄭 潔 歐仕益 黃才歡

（暨南大學食品科學與工程系 廣州510632）

丙烯酰胺具有生殖毒性和神經(jīng)毒性，在動物實驗中致癌[1-2]，被國際機構列入“人類可能致癌物”[3]。食品中的丙烯酰胺主要由羰基化合物與天冬酰胺在高溫加熱條件下通過美拉德反應產(chǎn)生[4-5]。形成途徑之一是通過美拉德反應形成3-氨基丙酰胺，其后在高溫下脫氨產(chǎn)生[6]。

前人研究表明，氨基酸氨基和巰基可與丙烯酰胺通過Michael 加成反應形成加合物[7-8]，從而消除丙烯酰胺[9-11]。3-氨基丙酰胺的C-3 的活潑氨基也可與丙烯酰胺發(fā)生Michael 加成反應，從而消除丙烯酰胺。本研究首次采用液-質譜聯(lián)用（HPLCMS-MS）鑒定3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺形成的加合物，并研究反應溫度、時間和反應物的比例對丙烯酰胺消除的影響，以期闡明3-氨基丙酰胺在丙烯酰胺的形成和消減中的貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3-氨基丙酰胺鹽酸鹽，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；丙烯酰胺，百靈威科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，天津市大茂化學試劑廠；色譜級甲醇，美國Mallinckrodt Baker 公司；純凈水。

1.2 儀器與設備

HR-200 電子分析天平，A & D 公司；SHIMADZMLC-20AT 高效液相色譜分析系統(tǒng)，日本島津儀器公司；SHIMADZU LC-MS 8045 液-質譜聯(lián)用分析系統(tǒng)，日本島津儀器公司；SBH200DC 數(shù)字式雙溫控干浴器，Stuart 公司；帶蓋20 mL 不銹鋼試管，自制。

1.3 方法

1.3.1 加合物的檢測 用pH8 的磷酸緩沖溶液配制50 mmol/L 3-氨基丙酰胺溶液，向不銹鋼試管中分別加入2 mL 3-氨基丙酰胺和2 mL pH 8 的磷酸緩沖溶液，旋緊管蓋，于160 ℃干浴器中反應20 min，冷卻至室溫。將試管中的樣品轉移到10 mL 容量瓶中，定容，用高效液相色譜法檢測生成物。

1.3.2 加合物的質譜鑒定

1.3.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱 （3.0 mm×100 mm，2.7-Micron）；流動相：乙腈-水溶液（20∶80，V/V）；柱溫40 ℃，流速0.4 mL/min，進樣體積0.5 μL。

1.3.2.2 質譜條件 ESI 離子源，正離子模式Q3掃描，電子能量-20 eV；霧化氣流量3.0 L/min，干燥氣流量10.0 L/min，加熱氣流量10.0 L/min；接口溫度300 ℃，DL 溫度250 ℃，加熱塊溫度400 ℃；準分子離子峰m/z 分別為160 與231，掃描范圍m/z 50～1 000。

1.3.3 反應條件對3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響

1.3.3.1 反應溫度對3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響 向不銹鋼試管中分別加入2 mL 50 mmol/L 3-氨基丙酰胺與2 mL 50 mmol/L 丙烯酰胺溶液，旋緊管蓋，然后將試管分別置于120，140，160，180 ℃和200 ℃的干浴器中反應20 min，考察不同反應溫度下3-氨基丙酰胺對丙烯酰胺的消減率。

1.3.3.2 反應時間對3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響 向不銹鋼試管中分別加入2 mL 50 mmol/L 3-氨基丙酰胺與2 mL 50 mmol/L 丙烯酰胺溶液，旋緊管蓋，將試管置于160 ℃的干浴器中分別加熱10，15，20，25 min 和30 min，考察不同反應時間下3-氨基丙酰胺對丙烯酰胺的消減率。

1.3.3.3 反應物的濃度比對3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響 將適量的丙烯酰胺和3-氨基丙酰胺添加到不銹鋼試管中，使其濃度比分別為1 ∶5，2∶5，3∶5，4∶5 和1∶1，3-氨基丙酰胺終濃度為25 mmol/L。旋緊管蓋，然后將試管置于160 ℃的干浴器中分別加熱20 min，考察丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺的濃度比對丙烯酰胺消減率的影響。

1.4 丙烯酰胺的檢測

色譜條件：色譜柱：Atlantis T3，4.6mm×150 mm，5 μm；流動相：甲醇（A）和超純水（B），梯度洗脫條件為：0～4 min：10% A；4.01～5 min：10%～80%A；5.01～8 min：80% A，；8.01～9 min：80%～10% A；9.01～15 min：10% A；流速0.7 mL/min，進樣量5 μL，柱溫40 ℃，檢測波長205 nm。

1.5 丙烯酰胺消減率的計算公式

式中：A1——丙烯酰胺單獨加熱后體系中丙烯酰胺的量；A2——3-氨基丙酰胺單獨加熱后體系中丙烯酰胺的量；A3——3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺混合加熱后體系中丙烯酰胺的量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

對每種處理做3 次平行試驗，用SPSS 17.0處理試驗數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 加合物

采用高效液相色譜法檢測3-氨基丙酰胺在160 ℃反應20 min 后的樣品，結果發(fā)現(xiàn)樣品的譜圖中不僅有3-氨基丙酰胺和丙烯酰胺的吸收峰，還出現(xiàn)兩個新的吸收峰（圖1）。同時，3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺也出現(xiàn)同樣的兩個新吸收峰，推測3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺之間發(fā)生相互作用。

圖1 3-氨基丙酰胺樣品160 ℃反應20 min 后的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatography of the reaction products after heating 3-aminopropanamide at 160 ℃for 20 min

圖2 3-氨基丙酰胺和丙烯酰胺可能形成的加合物Fig.2 Possible adduct formed between 3-aminopropanamide and acrylamide

2.2 加合物的質譜鑒定

2.2.1 質譜分析 在電噴霧正離子模式下，檢測新的吸收峰中物質的分子質量。由圖3可見，新的吸收峰中有2 個物質，它們均以[M+H]+準分子離子峰形式存在（m/z 分別為160 和231），同時出現(xiàn)的還有它們的加鈉峰[M+Na]+（m/z 182 和253）。由于3-氨基丙酰胺C-3 的活潑氨基可與丙烯酰胺發(fā)生邁克爾加成反應，新吸收峰中的物質很可能是按圖2的反應途徑生成2 種加合物。

進一步分析新組分的結構及其質譜裂解途徑，對2 個新組分的ESI-MS2碰撞誘導裂解進行研究。化合1 的準分子離子[M+H]+為m/z 160，由圖4a 可知，在二級質譜圖中出現(xiàn)兩個相對豐度較高的碎片離子m/z 101 和m/z 84。其中m/z 101是加合物與N-4 位相連的C-C 鍵裂解后生成（N-裂解[12-13]），繼而在其羰基側發(fā)生裂解給出m/z 84；另外，非專一性N 原子上的氫轉移而產(chǎn)生了m/z 72（C3H6NO·）?；? 的準分子離子[M+H]+為m/z 231（圖4b），在二級質譜圖中相對豐度最高的碎片離子m/z 172，是加合物發(fā)生N-裂解失去烷基酰胺產(chǎn)生；其中m/z 101 是加合物與N-4 位相連的C-C 鍵裂解后生成 （N-裂 解），而m/z72（C3H6NO·）同樣為非專一性N 原子上的氫轉移后生成，由此推測加合物的分子結構及分子碎片見圖5。

圖3 3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺加合物的質譜圖（正離子模式）Fig.3 Spectrum of the reaction products between 3-APA and acrylamide （in positive ionisation mode）

圖4 加合物的二級質譜（a：相對分子質量159，b：相對分子質量230）Fig.4 MS-MS spectrum of the reaction product 1 （MW=159，a） and reaction product 2 （MW=230，b）

圖5 正離子模式下3-氨基丙酰胺-丙烯酰胺加合物的結構式及碎片信息Fig.5 Predicted chemical formulas and molecular fragments information of 3-APA-acrylamide adducts in positive mode

2.2.2 加合物的高分辨質譜分析 采用高分辨質譜測定加合物的相對分子質量，并擬合出相對分子質量為159 和230 的產(chǎn)物的分子式分別為C6H13N3O2與C9H18N4O3。由2.2.1 節(jié)可知，加合物2為3，3'，3'-次氮基三丙酰胺，在正離子模式下，比較標準品與加合物2 的二級質譜（圖6），其相對分子質量與碎片信息高度吻合。

圖6 正離子模式下標準品（a）與加合物2（b）的高分辨二級質譜圖Fig.6 HRMS-MS of the standard （a） and reaction product 2 （b） in positive mode

2.3 反應條件對3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響

2.3.1 反應溫度對3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響 隨著溫度的不斷上升，3-氨基丙酰胺產(chǎn)生的丙烯酰胺逐漸增多，并在200 ℃時達到最大值，丙烯酰胺濃度隨著溫度的上升而略有下降，不明顯；而丙烯酰胺消減率隨著溫度的不斷升高呈先上升后下降的趨勢，在160 ℃時消減率達到最大值43.37%（表1）。其原因可能是由于120 ℃時，3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺的加合反應較為緩慢，導致丙烯酰胺消減率不高。隨著溫度的不斷上升，反應程度不斷增加，160 ℃時消減率達到最大值；隨后隨著溫度的進一步上升，丙烯酰胺消減率不斷下降，說明高溫促進了3-氨基丙酰胺轉化為丙烯酰胺。

2.3.2 反應時間對3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響 3-氨基丙酰胺單獨加熱時，隨著反應時間的延長，丙烯酰胺產(chǎn)生量逐漸增多，反應時間為30 min 時，丙烯酰胺的產(chǎn)生量比加熱10 min 時增加13 倍。丙烯酰胺單獨加熱體系中，其含量隨著加熱時間的延長略有下降。在3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺同時加熱的體系中，丙烯酰胺的消減率隨著加熱時間的增加呈先上升后下降的趨勢，當加熱時間在20 min 時，丙烯酰胺的消減率達到最大值43.37%（表2）。其原因可能是160 ℃下，隨著加熱時間的延長反應程度不斷加大，在20 min 時丙烯酰胺消減率達到最大值；之后隨著加熱時間的延長，可加合物在此條件下不穩(wěn)定，逐漸分解，重新釋放出3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺，導致丙烯酰胺消減率不斷下降。

表1 不同溫度對丙烯酰胺消減的影響Table 1 Effect of different temperature on acrylamide elimination

表2 加熱時間對丙烯酰胺消減的影響Table 2 Effect of heating time on acrylamide elimination

2.3.3 反應物的濃度比對3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響 3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的量隨著丙烯酰胺添加量的不斷增大呈先上升后下降的趨勢，當丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺濃度比為3∶5 時，丙烯酰胺消減率達到最大值47.29%。通過對比液相色譜圖發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺濃度較低時形成的加合物有兩種，而當丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺濃度比增大到3∶5 時所形成的加合物僅1 種。其原因可能為加合反應的類型有兩種，當丙烯酰胺的量較少時，1 分子的丙烯酰胺與1分子的3-氨基丙酰胺通過邁克爾加成反應形成相對分子質量為159 的加合物1 后，部分加合物1 再與一分子的丙烯酰胺繼續(xù)反應形成加合物2（相對分子質量為230）。而當丙烯酰胺的量不斷增大時，反應向著生成相對分子質量為230 的加合物的方向進行，消耗了體系中的加合物1；當丙烯酰胺過量時，由于3-氨基丙酰胺不足，過量的丙烯酰胺無法通過形成加合物被消減，導致丙烯酰胺的消減率下降。

3 結論

采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術對3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺通過邁克爾加成反應形成的產(chǎn)物進行研究，結果表明：3-氨基丙酰胺不僅能在高溫下脫氨形成丙烯酰胺，也可與生成的丙烯酰胺通過邁克爾加成反應形成兩種加合物，其相對分子質量分別為159 與230?？疾觳煌磻獥l件對3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響，發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺消減率隨溫度、時間、丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺的濃度比的增加呈先上升后下降的趨勢；當丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺濃度之比較低時，體系中同時存在加合物1 和加合物2；而當丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺濃度增加到3 ∶5 時，體系中有47.29%的丙烯酰胺被消除，且反應產(chǎn)物只有由2分子的丙烯酰胺與1 分子的3-氨基丙酰胺形成的加合物2。

表3 丙烯酰胺添加量對丙烯酰胺消減的影響Table 3 Addition amounts of acrylamide on the effect of acrylamide elimination

本研究發(fā)現(xiàn)兩種丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺的加合物，為美拉德反應中產(chǎn)物的相互作用機制提供了理論基礎。