葉肖辰皓，姜珊珊，葉 敏**

（1.煙臺(tái)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201）

干巴菌（Thelephora ganbajun） 也叫對(duì)花菌、馬牙菌，是傘菌綱（Agaricomycetes） 革菌目（Thelephorales） 革菌科（Thelephoraceae） 革菌屬（Thelephora） 的1種風(fēng)味獨(dú)特的高等可食用真菌[1]。干巴菌對(duì)生態(tài)環(huán)境要求特殊、地域分布特征極為明顯，僅分布在云南省的昆明、呈貢、嵩明、安寧、楚雄、易門、保山、曲靖、馬龍等地海拔為1 000 m～2 200 m的弱酸性紅土山林中，且該菌與松樹有外生菌根關(guān)系，難以實(shí)現(xiàn)人工栽培[2-4]。干巴菌不僅具備獨(dú)特、濃郁鮮香的風(fēng)味，還富含氨基酸、蛋白質(zhì)、黃酮、粗多糖、礦質(zhì)元素、維生素等大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值，是1種極具云南特色的珍貴野生食用菌[5-6]。經(jīng)廣泛的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外對(duì)干巴菌的研究十分有限，現(xiàn)有研究主要集中在分類、菌種分離、營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定和生態(tài)學(xué)關(guān)系等方面，對(duì)其揮發(fā)性化學(xué)成分的分析研究相對(duì)較少。呂瑜平等[7]采用水蒸氣蒸餾和乙醚萃取法提取干巴菌的揮發(fā)油，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 分離和鑒定了云南干巴菌中揮發(fā)成分。王茜茜等[7]分別采用靜態(tài)頂空和頂空固相微萃取法，提取云南野生干巴菌的香氣成分，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行定性定量分析，對(duì)2種方法所得的香氣成分進(jìn)行了比較。

固相微萃?。╯olid-phase micro-extraction,SPME），適用于分析揮發(fā)性有機(jī)化合物。由于熔融石英纖維涂附的固定相不同，對(duì)各種不同待測(cè)物質(zhì)的吸附和富集能力差異較大，使用固相微萃取技術(shù)進(jìn)行揮發(fā)性化學(xué)成分分析，必須正確選擇和使用不同類型的吸附纖維。

檢索現(xiàn)有文獻(xiàn)結(jié)果表明，采用不同種類的固相微萃取吸附纖維萃取干巴菌揮發(fā)性化學(xué)成分，并用氣質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行分析的研究鮮有報(bào)道。采用Carboxen/PDMS、PDMS和DVB/CAR/PDMS三種不同特性的SPME吸附纖維，利用頂空（head space，HS） 萃取干巴菌的揮發(fā)性化學(xué)成分，并用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析，通過比較3種吸附纖維所吸附的揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量的差異，推測(cè)干巴菌的主要香氣成分，為后續(xù)干巴菌的揮發(fā)性化學(xué)成分的系統(tǒng)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試野生干巴菌采自昆明市富民縣羅免鄉(xiāng)山地松樹林，樣品采摘后立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行揮發(fā)性化學(xué)成分的SPME頂空收集。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent 7890A/5975N（美國(guó)Agilent公司）；HP-5MS石英毛細(xì)管柱，30.00 m×0.25 mm × 0.25 μm （美國(guó) J&W Scientific 公司）；電子分析天平（AL-104型）、Mettler Toledo（儀器有限公司）；固相微萃取手動(dòng)進(jìn)樣手柄（57330-Supelco）、美國(guó)（Supelco公司）；固相微萃取頭，100 μm PDMS、 75 μm Carboxen/PDMS 和 50/30 μm DVB/CAR/PDMS（美國(guó)Supelco公司）；50 mL頂空萃取瓶（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

將洗凈的50 mL頂空萃取瓶至于180℃下烘烤1 h，除去瓶中揮發(fā)性物質(zhì)，冷卻后將5 g干巴菌置于其中，25℃平衡60 min后分別使用3種SPME纖維（100 μm PDMS、75 μm Carboxen/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS）吸附其揮發(fā)物。SPME纖維在使用前，于250℃、50 mL·min-1條件下氮吹老化30 min，然后將SPME纖維插入頂空萃取瓶吸附30 min后立即在GC-MS進(jìn)樣口230℃解吸附5 min，同時(shí)進(jìn)行GC-MS數(shù)據(jù)采集。

1.3.1 氣相色譜條件

柱箱初始溫度40℃，保持2 min，以5℃·min-1升至250℃，保持6 min，總運(yùn)行時(shí)間50 min；進(jìn)樣口溫度為230℃；載氣為高純氦氣（純度99.999%），流量 1.0 mL·min-1，無(wú)分流進(jìn)樣。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式為電子轟擊（EI） 電離，電離能量70 eV；接口溫度280℃，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，離子掃描范圍m/z 50～550；溶劑延時(shí)4 min。

1.3.3 化合物定性與定量

經(jīng)NIST 08質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索定性，按相似度＞80%的原則作為鑒定結(jié)果，按峰面積歸一化法計(jì)算化合物的相對(duì)百分含量。

2 試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 干巴菌揮發(fā)性化學(xué)成分的組成

用3種不同極性的SPME吸附纖維吸附干巴菌的揮發(fā)性化學(xué)成分，并用GC-MS進(jìn)行分析鑒定。3種不同吸附纖維所得的GC-MS總離子流圖如圖1所示。

從圖1可以看出，在檢測(cè)到的干巴菌揮發(fā)性成分中硫醚類和烯烴類化合物在含量較高，是干巴菌的主要揮發(fā)性化學(xué)成分。在分離鑒定的24種揮發(fā)性化學(xué)成分中，含有烯烴類化合物8種、醇類化合物4種、苯2種、酮、肟、硫醚類化合物各1種，另有其他化合物7種，詳見表1。

圖1 不同SPME吸附纖維萃取干巴菌揮發(fā)性化學(xué)成分的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds of Thelephora ganbajun extracted by different SPME fiber coating

由表1可知，不同的SPME吸附纖維對(duì)干巴菌揮發(fā)性成分吸附的種類有較大差異。DVB/CAR/PDMS共檢測(cè)到21種揮發(fā)性成分，Carboxen/PDMS共檢測(cè)到11種揮發(fā)性成分，而PDMS僅檢測(cè)到有3種揮發(fā)性成分，PDMS是3種SPME吸附纖維中吸附揮發(fā)性化學(xué)成分最少的1種吸附纖維。有少數(shù)的化合物能被3種SPME纖維吸附，而大多數(shù)化合物則只能被1種或2種纖維吸附。Carboxen/PDMS和DVB/CAR/PDMS共同檢測(cè)到的組分有二甲基二硫醚（Dimethyl disulfide）、二甲基硅氧烷環(huán)三聚物（Dimethylsiloxane cyclic trimer）、1R-α-蒎烯（1R-α-Pinene）、莰烯 （Camphene）、 (-)-α-蒎烯（(-)-α-Pinene）、八甲基環(huán)四硅氧烷 （Oktamethylcyklotetrasiloxan）、桉葉油醇（Eucalyptol）、1-十一烯（1-Undecene）、 (-)-樟腦（(-)Camphor） 和十甲基環(huán)戊硅 氧 烷 （Decamethylcyclopentasiloxane）。 PDMS、Carboxen/PDMS和DVB/CAR/PDMS三種吸附纖維共同檢測(cè)到的組分僅有1-十一烯（1-Undecene）。

表1 3種不同吸附纖維萃取的干巴菌揮發(fā)性化學(xué)成分及其相對(duì)含量Tab.1 The volatile compounds and their relative contents of Thelephora ganbajun extracted by three different SPME fiber coatings

2.2 不同SPME吸附纖維吸附揮發(fā)性成分能力的差異

PDMS、Carboxen/PDMS和DVB/CAR/PDMS 3種吸附纖維吸附化合物的總峰面積如圖2所示。

圖2 3種不同SPME纖維吸附干巴菌揮發(fā)性成分的總峰面積Fig.2 Total peak areas of volatile compounds of Thelephora ganbajun extracted by different SPME fiber coating

圖2研究結(jié)果表明，不同的SPME吸附纖維對(duì)揮發(fā)性化學(xué)成分的吸附能力不同，其中Carboxen/PDMS的吸附能力最強(qiáng)；DVB/CAR/PDMS次之，Carboxen/PDMS吸附的總峰面積為 76.17%；而PDMS吸附能力最弱，吸附的總峰面積僅為Carboxen/PDMS的3.89%。3種不同SPME吸附纖維對(duì)干巴菌中不同揮發(fā)性化學(xué)成分的吸附能力差異很大，具體試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，各吸附纖維對(duì)不同揮發(fā)性化學(xué)成分的吸附能力差異很大，Carboxen/PDMS對(duì)二甲基二硫醚表現(xiàn)出特異的高吸附能力；DVB/CAR/PDMS對(duì)二甲基二硫醚也表現(xiàn)出較高的吸附能力，而PDMS則對(duì)二甲基二硫醚無(wú)響應(yīng)；3種纖維對(duì)1-十一烯均能吸附，但DVB/CAR/PDMS的吸附能力最強(qiáng)，Carboxen/PDMS次之，PDMS的吸附能力最弱。

圖3 3種不同吸附纖維萃取的干巴菌揮發(fā)性化學(xué)成分峰面積比較Fig.3 Comparison of volatile compounds from Thelephora ganbajun extracted by three different fiber coating

3 討論

云南因其特殊的地理環(huán)境和獨(dú)特的氣候條件，非常適合野生食用菌的生長(zhǎng)。云南的野生食用菌種類占中國(guó)野生食用菌種類的67%以上，占全世界野生食用菌種類的50%[1]。在云南眾多的野生食用菌中，干巴菌是一種風(fēng)味獨(dú)特的珍稀野生食用菌，因其香味濃郁、滋嫩香甜、肉質(zhì)堅(jiān)韌，且有一種酷似腌牛肉干的濃郁香味，而得名干巴菌，廣受人們喜愛。干巴菌除風(fēng)味獨(dú)特外還富含抗氧化物質(zhì)，Xu D.P等[8]采用超聲波輔助提取法提取干巴菌中的抗氧化物質(zhì)，研究了提取物對(duì)人體癌細(xì)胞的抗增生作用。研究結(jié)果表明，干巴菌的提取物對(duì)人體肺癌細(xì)胞（A549）、乳腺癌細(xì)胞 （MCF-7）、肝癌細(xì)胞（HepG2）和結(jié)腸癌細(xì)胞（HT-29） 均有抗增生作用，其中以對(duì)肝癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞的抗增生作用尤為顯著，干巴菌提取物中的蕓香甙（rutin）、2-苯丙酸（2-hydrocinnamic acid） 和表兒茶酸 （epicatechin），可能是抗氧化和抗增生作用的主要活性化合物。

固相微萃?。⊿PME）是一種新興的無(wú)溶劑特殊萃取方法，適用于各種揮發(fā)性有機(jī)化合物的萃取，被廣泛地應(yīng)用于花卉、蘑菇、葡萄酒等的香氣成分萃取和分析，關(guān)于其應(yīng)用已有很多文獻(xiàn)報(bào)道[9-12]。本研究中采用 Carboxen/PDMS、PDMS和 DVB/CAR/PDMS 3種不同特性的SPME吸附纖維，結(jié)合GCMS聯(lián)用技術(shù)從干巴菌中的共檢測(cè)到24種揮發(fā)性化學(xué)成分，這些揮發(fā)性化學(xué)成分主要為硫醚類和烯烴類化合物，相對(duì)含量大于5%的化合物有二甲基二硫醚、1R-α-蒎烯和1-十一烯，根據(jù)相對(duì)含量的占比來(lái)分析可以判斷野生干巴菌的特征香氣成分為二甲基二硫醚、1R-α-蒎和烯1-十一烯。Majid[9]研究表明HS-SPME法檢測(cè)到的云南野生干巴菌的揮發(fā)性成分有主要是醛類、酮類和弱極性的烴類化合物，本研究中也發(fā)現(xiàn)野生干巴菌中烴類化合物含量較高，但酮類化合物含量較低，沒有檢測(cè)到醛類化合物，這可能與野生干巴菌的生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)階段和所使用的SPME吸附纖維種類不同等因素有關(guān)。不同極性的SPME吸附纖維吸附揮發(fā)性成分差異明顯， Carboxen/PDMS檢測(cè)到11種揮發(fā)性成分，且對(duì)二甲基二硫醚具有特異的高吸附能力；在采用的3種SPME吸附纖維中，DVB/CAR/PDMS檢測(cè)到的揮發(fā)性成分最多，檢測(cè)到6種烯烴類化合物、3種醇類化合物、2種苯、1種硫醚類化合物、1種酮類化合物、1種肟類化合物和7種其他化合物，可能是因?yàn)镈VB/CAR/PDMS由碳分子篩和聚二甲基硅氧烷復(fù)合材料制成，該吸附纖維有較多微孔，能夠吸附痕量揮發(fā)性成分[13]，但其對(duì)二甲基二硫醚的吸附能力不如Carboxen/PDMS；PDMS僅檢測(cè)到3種揮發(fā)性成分，是試驗(yàn)選用的3種吸附纖維中檢測(cè)到揮發(fā)性成分最少的1種，證明PDMS不適用于干巴菌揮發(fā)性化學(xué)成分的萃取和分析。干巴菌揮發(fā)性化學(xué)成分的相對(duì)含量比較分析結(jié)果表明，干巴菌的主要揮發(fā)性化學(xué)成分是二甲基二硫醚、1R-α-蒎烯和1-十一烯，這三種化合物均具有特殊的香氣，可以推測(cè)這三種物質(zhì)是影響干巴菌風(fēng)味的關(guān)鍵揮發(fā)性化學(xué)成分。