鄭裕雄 ，曹際玲 ，楊智杰 *，林成芳 ，黃夢青 ，楊玉盛

1. 福建師范大學/濕潤亞熱帶山地生態(tài)國家重點實驗室培育基地，福建 福州 350007；2. 福建師范大學地理科學學院，福建 福州 350007

微生物是森林土壤中最為活躍的組分，能對土壤性質和環(huán)境脅迫的變化迅速作出反應，在土壤碳氮循環(huán)過程中起到至關重要的作用（Xiong et al.，2014）。目前，大部分研究表明植被類型能顯著改變土壤微生物群落結構和多樣性。韓世忠等（2015）利用磷脂脂肪酸（PLFA）研究兩種森林植被類型對土壤微生物群落結構的影響，發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落結構差異主要由植被類型差異引起，天然林土壤磷脂脂肪酸總量和各類群特征脂肪酸含量高于人工林。Potthast et al.（2012）研究發(fā)現(xiàn)植被類型變化能顯著改變土壤有機質和養(yǎng)分有效性，牧草場土壤真菌和革蘭氏陰性菌豐度顯著高于天然林。Wang et al.（2017）在海南島研究發(fā)現(xiàn)植被類型變化能顯著改變微生物群落組成及其功能，其中橡樹人工林細菌和叢枝菌根真菌豐度顯著低于熱帶雨林。此外，土壤微生物群落結構對植被類型變化的響應還受到季節(jié)性差異的影響。羅達等（2014）在南亞熱帶人工林發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落結構受到林分類型和季節(jié)的雙重因素影響，其旱季土壤微生物類群和總PLFA顯著高于雨季。而 Vorí?ková et al.（2014）在研究土壤微生物的季節(jié)動態(tài)時發(fā)現(xiàn)，夏季真菌生物量較春季增加了3倍，與植物光合產物的地下分配趨勢一致。亞熱帶地區(qū)氣象變化復雜，森林凋落物、土壤溫度和水分等因素的季節(jié)變化影響，導致不同季節(jié)間土壤微生物群落結構差異更加顯著（鄭裕雄等，2018），但果園受到除草翻耕、灌溉和施肥等人工管理措施的影響，土壤微生物群落結構對季節(jié)變化產生如何響應以及是否明顯仍不清楚。

長期以來，為取得經濟發(fā)展，滿足人們的需求，大面積常綠闊葉天然林經皆伐、煉山和整地后改造為桔園等果園，已使亞熱帶山區(qū)的植被類型發(fā)生了巨大的變化（楊智杰等，2010）。福建省現(xiàn)有果園面積5.42×105hm2，占全國果園面積的4.17%，相比森林生態(tài)系統(tǒng)，果園生態(tài)系統(tǒng)受到人為干擾的強度和頻度更為強烈，其對生態(tài)系統(tǒng)碳平衡起著重要作用（王超等，2012）。本研究以位于福建建甌萬木林自然保護區(qū)內保存較為完整的天然林為對照，選取臨近由天然林轉變而來的桔園為研究對象，采用PLFA分析技術探討亞熱帶山區(qū)土壤微生物群落結構對不同植被類型響應的季節(jié)動態(tài)特征，分析植被類型變化對土壤微生物環(huán)境響應力的影響，為維護土壤生態(tài)功能穩(wěn)定和促進山區(qū)資源的可持續(xù)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域與樣地概況

研究區(qū)設在福建省建甌市萬木林自然保護區(qū)（27°03′N，118°09′E），地處武夷山脈東南坡，屬中亞熱帶濕潤季風氣候，年均氣溫 19.4 ℃，年均降水量1731 mm（主要集中在4—6月），年均蒸發(fā)量1466 mm，相對濕度81%。保護區(qū)地貌為東南低山丘陵，土壤為發(fā)育在花崗巖和片麻巖之上的南方山地黃紅壤。

試驗地林分基本特征如表1所示。天然林以米櫧（Castanopsis carlesii）為主要建群種，喬木層由薄葉山礬（Symplocos anomala）、木荷（Schima superba）、浙江桂（Cinnamomum chekiangense）、絲栗栲（Castanopsis fargesii）及臺灣冬青（Ilex formosana）等組成。草本層以狗脊（Woodwardia japonica）和草珊瑚（Sarcandra glabra）為主。桔園是為 1985年天然林皆伐后人工種植形成，定期施肥，年施肥量0.35 t·hm-2，以復合型化肥NPK為主，旱季灌溉，每年除草翻耕 2—3次，病蟲害時適當噴灑農藥。土壤基本理化性質為：天然林 pH 5.28，容質量（容重）0.74 g·cm-1，土壤有機碳68.26 t·hm-2，水解氮 147 mg·kg-1，有效磷 2.11 mg·kg-1，年凋落物量5.96 t·hm-2；桔園pH 4.53，容質量（容重）1.14 g·cm-1，土壤有機碳 42.87 t·hm-2，水解氮119 mg·kg-1，有效磷 10.20 mg·kg-1，年凋落物量 2.65 t·hm-2（楊玉盛等，2007；黃夢清，2013）。

1.2 樣品采集

在米櫧天然林和桔園各隨機設置立地條件基本相似的3個20 m×20 m標準樣地，各相鄰兩個標準地之間的緩沖區(qū)相隔至少10 m。采用S形5點取樣法，分別于 2012年的春季、夏季、秋季和冬季（2013年1月）采集4次土樣，先將土壤表層枯枝凋落物去除，再用土鉆采集表層0—10 cm土壤，將每塊標準地的土樣混勻成1個土樣，用冰袋保存將其運回實驗室。于24 h內挑去根系、凋落物和碎石等，于-80 ℃冰箱保存，待土壤磷脂脂肪酸測定。

1.3 微生物群落結構

磷脂脂肪酸（PLFA）根據(jù) Frosteg?rd et al.（1993）方法命名，PLFA及微生物類型見表2。

采用溫和堿性甲酯化方法（Schutter et al.，2000）進行PLFA提取，簡單操作步驟：稱取10 g冷凍干燥后的鮮土，放于50 mL離心管中，加入23 mL提取液（6 mL氯仿，12 mL甲醇，5 mL磷酸緩沖液），渦旋振蕩20 s，超聲10 min，重復3次，離心（20 ℃，2500 r·min-1，10 min）后轉移上層清液到另一個干凈的50 mL離心管，剩余土壤重復上述步驟進行二次提取，將兩次提取液合并后充分混勻，在黑箱靜置一夜（8 h）。收集下層氯仿相，用 N2吹干，通過硅膠柱分離出磷脂。最后進行甲基化，加入1 mL甲醇甲苯混合液（1:1，V/V）洗吹干樣，渦旋 30 s，再加入 1 mL KOH溶液（0.2 mol·L-1），80 r·min-1低速振蕩 5 min 后，在 37 ℃水浴鍋中水浴10 min，再依次加入3 mL冰醋酸溶液（1 mol·L-1）、10 mL 正己烷，充分搖勻離心（4 ℃，2000 r·min-1，15 min）后，轉移上清液（正己烷相）到干凈試管，再向剩余溶液中加入10 mL正己烷重新浸提，轉移上層清液到試管，將兩次溶解有脂肪酸的己烷溶液合并后充分混勻，氮吹干。用 1 mL甲基叔丁基醚-正己烷溶液（1:1，V/V）洗至樣品瓶中，-20 ℃冰箱保存。上機前，用19:0甲酯作為內標溶液，用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GC-MS）（7890A-5973C，Agilent，USA）進行PLFA的測定。

表1 試驗地林分基本特征Table 1 Stand characteristics of study plantations

表2 土壤微生物種群磷脂脂肪酸標記物及其特征比值Table 2 The markers and characteristic ratio of PLFA in soil

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用香農-威納（Shannon-Wiener）豐富度指數(shù)和辛普森（Simpson）優(yōu)勢度指數(shù)來表征土壤微生物多樣性（徐贏華等，2010）。

Shannon指數(shù)：

Simpson指數(shù)：

式中，ni是第i種個體數(shù)；N是所在群落所有物種個體數(shù)之和。

參照Luo et al.（2006）的方法計算響應率，以天然林微生物類群PLFA為對照，研究植被類型變化導致土壤微生物類群分異的特定 PLFA。當響應率數(shù)值大于0，表征微生物類群特定PLFA對植被類型變化呈正響應；小于0，則呈負響應。

數(shù)據(jù)運用Excel 2010和SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析。采用雙因素方差分析法（Two-way，ANOVA）分析植被類型、季節(jié)及其交互作用對各指標的影響，采用 Tukey多重比較法進行差異顯著性檢驗（P＜0.05），繪圖由Origin 9.0完成。運用Canoco 5.0對土壤微生物群落結構的變化進行主成分分析（PCA）。數(shù)據(jù)為平均值±標準誤。

2 結果與分析

2.1 植被類型對不同季節(jié)土壤微生物 PLFA含量變化的影響

從圖1可知，天然林和桔園土壤微生物主要以細菌為優(yōu)勢類群，分別占微生物總 PLFA含量的41.04%和48.01%。天然林微生物類群PLFA含量全年均顯著高于桔園，其中桔園夏季微生物類群PLFA含量下降幅度最大，達到 69.3%。天然林和桔園土壤微生物類群PLFA含量隨著季節(jié)變化均顯著下降，微生物類群最高PLFA含量均出現(xiàn)在春季，而天然林微生物類群最低PLFA含量出現(xiàn)在冬季，桔園夏季PLFA含量最低。

圖1 兩種植被類型土壤微生物PLFA含量的季節(jié)變化Fig. 1 Seasonal variation of PLFA content of soil microorganisms in two vegetation types

2.2 植被類型對不同季節(jié)土壤微生物特征比值的影響

從圖 2可知，天然林春季 F:B比桔園顯著低18.74%，而夏、秋和冬季比桔園分別顯著高61.45%、52.04%和57.99%。天然林春季G+:G-比桔園顯著高出19.40%，夏季比桔園顯著低42.01%，而秋冬季節(jié)無顯著差異。天然林全年 Cy:Pre均顯著高于桔園，平均高出66.31%。天然林春夏季節(jié)Iso:Ant比桔園分別顯著低8.96%和13.36%，而秋冬季節(jié)無顯著差異。天然林和桔園Cy:Pre和Iso:Ant隨季節(jié)變化均表現(xiàn)為先上升后下降，在夏季出現(xiàn)最大值。

2.3 植被類型對不同季節(jié)土壤微生物群落多樣性的影響

從表3可知，天然林夏季土壤微生物群落豐富度指數(shù)比桔園顯著低1.63%，而優(yōu)勢度指數(shù)比桔園顯著高30.75%，這表明天然林夏季土壤微生物群落多樣性顯著低于桔園。天然林春季土壤微生物群路豐富度指數(shù)比桔園顯著高1.16%，而優(yōu)勢度指數(shù)比桔園顯著低3.82%，這表明天然林夏季土壤微生物群落多樣性顯著高于桔園。天然林和桔園土壤微生物群落豐富度指數(shù)最低值均出現(xiàn)在夏季，冬季優(yōu)勢度指數(shù)均最高，這表明兩種植被冬季土壤微生物群落多樣性最高，而夏季多樣性最低。

表3 植被類型變化對不同季節(jié)土壤微生物群落多樣性的影響Table 3 Effects of vegetation types change on soil microbial community diversity in different seasons

2.4 植被類型對不同季節(jié)土壤微生物群落結構的影響

圖2 兩種植被類型土壤微生物PLFA特征比值的季節(jié)變化Fig. 2 Seasonal variation of PLFA characteristic ratio of soil microorganisms in two vegetation types

圖3 植被類型和季節(jié)對土壤微生物群落結構影響主成分分析Fig. 3 Principal component analysis (PCA) of the effects of vegetation type on soil microbial community structure relative to season

利用主成分分析法進一步分析植被類型和季節(jié)變化對土壤微生物群落結構的影響。從圖3可知，主成分 1（PC1）對類群 PLFA 變異的解釋率達56.70%，主成分2（PC2）的解釋度達到21.86%，共同解釋變異的78.56%。天然林與桔園不同季節(jié)土壤微生物群落結構發(fā)生顯著分異。

對影響天然林和桔園季節(jié)土壤微生物群落結構的主成分進行得分值計算（表4），在主成分1和主成分2中，植被類型和季節(jié)雙因素主成分得分值均具有明顯差異性，表明季節(jié)和植被類型雙因素變化對微生物群落結構產生顯著影響。

表4 土壤微生物群落結構主成分得分值的差異顯著性分析（F值）Table 4 Significance analysis of the difference between principal components of the soil microbial community in score value (F value)

從表5可知，除季節(jié)未對F:B產生顯著影響，季節(jié)變化和植被類型雙因素均對土壤微生物群落結構產生顯著的影響，這表明土壤微生物群路對植被類型變化的響應隨著季節(jié)變化會發(fā)生顯著變異。

2.5 植被類型對不同季節(jié)土壤微生物群落特定PLFA的影響

以天然林特定PLFA為對照，利用響應率曲線進一步分析造成桔園和天然林土壤微生物群落差異的特定PLFA。從圖4可知，桔園不同季節(jié)的土壤微生物群落特定PLFA含量基本均顯著低于天然林，不同 PLFA含量的差異幅度不同。除 16:1w7t、Cy:17:00和Cy:19:00外，桔園春季其余細菌PLFA標記物豐度顯著下降導致細菌豐度下降的幅度高于天然林，而真菌 18:1w9t標記物豐度顯著增加導致真菌豐度下降的幅度低于天然林。桔園春季G+標記物豐度顯著下降導致 G+豐度下降的幅度高于天然林，而G-細菌Cy:17:00、16:1w7t和18:1w7t標記物豐度增加導致G-豐度下降的幅度低于天然林。

表5 季節(jié)和植被類型變化及其相互作用對土壤微生物群落結構影響的顯著性分析Table 5 Significance analysis of the effects of vegetation types change，season and their interactions on soil microbial community structure

圖4 植被類型變化對土壤微生物特定PLFA季節(jié)動態(tài)的影響（95%的置信區(qū)間）Fig. 4 Effects of vegetation types change on seasonal dynamics of soil microbial specific PLFA at a 95% confidence interval

3 討論

土地覆被的變化是土壤微生物變化的驅動力，通過改變凋落物、根系分泌物及有機碳等影響土壤養(yǎng)分貯存和底物有效性。本研究發(fā)現(xiàn)，相比天然林，桔園土壤微生物類群PLFA含量顯著降低，這可能與桔園管理措施改變土壤地下碳分配，進而影響土壤底物有效性有關。前期研究（Yang et al.，2003；郭劍芬等，2006）也發(fā)現(xiàn)，果園年凋落物量比天然林下降5.83%，細根生物量也顯著降低。陳香碧等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，與原生林地相比，受人為干擾的生態(tài)系統(tǒng)土壤細菌豐度顯著下降。隨著桔園長期施肥，土壤pH降低，土壤酸化抑制了土壤微生物生長和活性，降低類群PLFA含量。張逸飛等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，種植單一樹種和農業(yè)管理措施造成土壤有機質和養(yǎng)分含量下降，導致土壤酸化，對土壤微生物群落造成負面影響。此外，桔園土壤長期種植單一作物，受除草翻耕和施肥等人為管理措施影響較大，導致地上植被覆蓋率低，根系分泌物多樣性較低，進而定向選擇出能很好適應其環(huán)境的土壤微生物，導致土壤微生物群落多樣性下降。鄧嬌嬌等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，人工林和農業(yè)用地土壤養(yǎng)分急劇下降，總碳源的利用能力降低，從而造成微生物群落多樣性降低。本研究中，夏季桔園微生物多樣性顯著高于天然林，這可能是與地表植被增加有關。杜毅飛等（2015）研究生草果園時發(fā)現(xiàn)地上植被增加能為果園土壤輸入大量凋落物及其根系分泌物，改變土壤理化性質，提高了土壤微生物對碳源的利用能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，季節(jié)和植被類型變化能顯著改變土壤微生物群落結構（圖3）。天然林和桔園土壤微生物類群最高PLFA含量均出現(xiàn)在春季，天然林微生物類群最低PLFA含量出現(xiàn)在冬季，桔園夏季含量最低。李南潔等（2017）在縉云山柑橘林研究時發(fā)現(xiàn)季節(jié)更替對土壤微生物有顯著影響，類群PLFA含量均表現(xiàn)出春季最高，夏冬季節(jié)含量最低，這可能受到土壤溫度和水分變化影響造成的。不同季節(jié)微生物類群特定PLFA含量下降幅度不同，會導致微生物對環(huán)境變化的響應能力以及生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性變化的響應程度不同。桔園夏、秋和冬季F:B顯著低于天然林，這與葉晶等（2016）研究發(fā)現(xiàn)耕地F:B比值和土壤穩(wěn)定性顯著低于黃山松林地的結果相同。但本研究中春季桔園F:B顯著高于天然林（圖 2），表明春季桔園土壤微生物群落結構穩(wěn)定性高于天然林。這主要因為春季換葉期凋落物量降低，減弱地表林冠層和凋落物淋溶作用；同時，處于生長季的桔樹將大量光合作用產物用于增加細根生物量，從土壤吸收大量養(yǎng)分供植物生長換葉，導致根系向土壤輸送的易分解有機碳大量減少。土壤中富營養(yǎng)型的細菌因可利用的易分解有機碳含量大量減少而降低，貧營養(yǎng)型的真菌分解利用土壤中低營養(yǎng)和難分解的木質素等高碳氮比有機質維持自身代謝（Blagodatskaya et al.，2007；Ingwersen et al.，2008），生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性增加。春季桔園G+:G-比值顯著高于天然林，表明春季降低桔園土壤營養(yǎng)脅迫壓力。春季細根周轉迅速，G-易于利用根系凋落物進行代謝（Moore-Kucera et al.，2008），而夏季 G-標記物豐度下降幅度大于G+，這可能與土壤溫度有關。桔樹低矮且林冠郁閉度較天然林低，夏季溫度高，土壤水分蒸發(fā)快，陽光可直射透過林冠和地表稀少的草本層加快土壤溫度的上升，也會限制G-生長。楊林等（2016）在高山森林模擬增溫對土壤微生物群落結構影響的研究，發(fā)現(xiàn)溫度升高顯著降低土壤有機層G-標記物含量，引起G+:G-升高。

此外，土壤微生物群落可通過改變某些特殊脂肪酸含量來響應植被變化導致的環(huán)境脅迫。Cy:Pre反映土壤微生物所處的養(yǎng)分壓力狀態(tài)，其值越高表示微生物對養(yǎng)分競爭越厲害。本研究發(fā)現(xiàn)，天然林和桔園微生物最大Cy:Pre均出現(xiàn)在夏季，表明夏季土壤微生物類群對養(yǎng)分競爭激烈。Moore-Kuceraet al.（2008）研究不同林齡黃杉土壤微生物群落結構季節(jié)動態(tài)時發(fā)現(xiàn)，夏季微生物Cy:Pre增加，這主要受到水分壓力變化造成的脅迫影響。桔園全年Cy:Pre顯著低于天然林（圖2），主要是Cy19:00標記物豐度下降造成（圖4），這可能是桔園土壤中易被利用分解的有機碳含量降低，導致微生物類群對養(yǎng)分的競爭減弱。楊東偉等（2018）在中國浙江研究時發(fā)現(xiàn)，相較于水田，桔園耕層土壤微生物的養(yǎng)分脅迫和所處壓力增強，微生物數(shù)量降低，這主要與天然林轉變?yōu)榻蹐@后土壤養(yǎng)分含量不均衡有關。Iso:Ant反映微生物對環(huán)境脅迫的適應力，其值越高表示土壤微生物對環(huán)境脅迫的適應力越強。天然林春夏季節(jié) Iso:Ant顯著低于桔園，表明天然林微生物對養(yǎng)分需求的競爭對其抵抗環(huán)境變化的能力產生負面影響。

4 結論

植被類型對土壤微生物群落結構和多樣性產生較大影響。天然林土壤微生物類群PLFA含量全年顯著高于桔園，但不同季節(jié)土壤微生物變化類群不同，變化程度也不同，即植被類型變化對土壤微生物類群的影響表現(xiàn)出一定的季節(jié)差異性。此外，植被類型顯著改變土壤微生物群落 F:B和春夏季G+:G-，并使不同結構的環(huán)丙烷脂肪酸或異構脂肪酸等特殊脂肪酸比值發(fā)生改變，表明季節(jié)變化在一定程度上改變土壤微生物群落對環(huán)境變化的抵抗能力。