倪潤(rùn)芳，黃秋英，錢思雨，李騰文，蘇國(guó)強(qiáng)*，李慶閣*

(1.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，分子診斷教育部工程研究中心，福建 廈門 361102；2.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外三科，福建 廈門 361005)

近年來(lái)，對(duì)化療無(wú)效的結(jié)直腸癌患者治療研究中，在表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)靶向藥物治療方面取得重大進(jìn)展，顯著改善了轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的存活率[1].結(jié)直腸癌患者中Kras基因突變率為35%～40%[2]，其中90%的突變發(fā)生在外顯子2的密碼子12和13上[3](密碼子12上發(fā)生頻率為70%，密碼子13上的發(fā)生頻率為30%)，而極少發(fā)生在密碼子61和63上.美國(guó)綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)將Kras突變檢測(cè)列入結(jié)直腸癌患者常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，并明確指出必須進(jìn)行密碼子12和13上突變的檢測(cè)，其中常見(jiàn)的7種熱點(diǎn)突變及其發(fā)生頻率見(jiàn)表1.結(jié)直腸癌患者發(fā)生任何一種上述類型的Kras突變均表現(xiàn)為對(duì)EGFR靶向藥物的耐受[4].因此，準(zhǔn)確檢測(cè)Kras突變有十分重要的臨床意義.

腫瘤基因突變是發(fā)生在實(shí)體瘤中的體細(xì)胞突變，表現(xiàn)為混雜有大量野生型基因組的低含量突變，故稱為稀有突變.近年來(lái)，利用外周血循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)[5-7]進(jìn)行腫瘤稀有突變無(wú)創(chuàng)檢測(cè)成為熱點(diǎn)，而ctDNA中突變率更低，一般低于0.5%[8].因此，必須提高稀有突變檢測(cè)方法的靈敏度.目前，有多種針對(duì)Kras突變的檢測(cè)方法，主要包括等位基因特異性PCR(AS-PCR)、擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(ARMS)、高分辨率熔解分析(HRM)、低溫變性共擴(kuò)增PCR(COLD-PCR)、下一代測(cè)序(NGS)以及基于小珠、乳濁液、擴(kuò)增、磁性的數(shù)字PCR-流式技術(shù)(BEAMing)和數(shù)字PCR(dPCR)等.然而這些方法的分析靈敏度大多有限(1%～5%)，難以檢測(cè)低豐度的Kras突變[9].雖然BEAMing[10]和dPCR[11]方法的分析靈敏度較高，可達(dá)0.1%左右，但是因?yàn)椴僮鞣爆嵡覚z測(cè)成本較高，在臨床上的應(yīng)用有限.基于以上研究現(xiàn)狀，臨床上迫切需要更加簡(jiǎn)便、價(jià)廉、靈敏度高的檢測(cè)方法用于檢測(cè)低豐度的Kras突變.

表1 Kras的7種常見(jiàn)突變類型及其發(fā)生頻率

注：c表示cDNA參考序列;p表示蛋白參考序列;34,35,38表示堿基在Kras基因序列中的位置.*來(lái)自于Cosmic數(shù)據(jù)庫(kù).

探針熔解曲線分析(MCA)是PCR后的產(chǎn)物分析技術(shù)[12]，利用探針與不同靶序列雜交后形成的雙鏈DNA熔點(diǎn)差異來(lái)區(qū)分不同靶序列，方法簡(jiǎn)捷，且閉管操作可防止樣本交叉污染，但其靈敏度一般在5%～10%.近年來(lái)，有多種DNA和RNA的類似物用于科學(xué)研究，其中鎖核酸(LNA)的應(yīng)用引起了廣泛關(guān)注.LNA是一種核苷酸衍生物[13]，和普通核苷酸分子的區(qū)別在于其碳環(huán)的2′-O和4′-C位置引入了亞甲基橋而形成鎖狀結(jié)構(gòu).LNA與DNA/RNA結(jié)合時(shí)遵循Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，且LNA的雜交親和性遠(yuǎn)高于相應(yīng)的DNA-DNA或RNA-RNA[14].據(jù)Wahlestedt等[15]報(bào)道，因?yàn)長(zhǎng)NA和DNA的結(jié)合導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生一定程度的改變，所以含有LNA堿基的寡核苷酸更能耐受核酸酶的作用，不易被降解.LNA不僅與DNA的親和度高，而且對(duì)堿基錯(cuò)配的敏感性高，因此可顯著增大完全匹配雙鏈與堿基錯(cuò)配雙鏈間的熱穩(wěn)定性差異，適合用于點(diǎn)突變檢測(cè).

本研究使用LNA修飾探針和MCA技術(shù)進(jìn)行Kras突變富集檢測(cè)，旨在建立一種簡(jiǎn)捷、高靈敏度的突變檢測(cè)方法，用于指導(dǎo)腫瘤患者個(gè)體化用藥，推進(jìn)分子診斷技術(shù)在精準(zhǔn)醫(yī)療等方面的臨床應(yīng)用.

1 材料與方法

1.1 材 料

293T細(xì)胞系不含Kras突變，作為野生型基因組標(biāo)準(zhǔn)品.采用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen，德國(guó))進(jìn)行基因組DNA提取.

結(jié)直腸癌標(biāo)本為冰凍組織標(biāo)本，由廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院提供.冰凍組織標(biāo)本經(jīng)手術(shù)切除后立即被分裝成小塊保存于液氮或-80 ℃冰箱中，提取前切取米粒大小的組織，使用TIANamp組織/細(xì)胞/血液全基因組DNA提取試劑盒(天根生物有限公司，北京)進(jìn)行提取.

以上提取獲得的DNA樣本用Spectrophotometer ND-1000(Nanodrop，美國(guó))測(cè)定吸光度，檢測(cè)提取質(zhì)量和濃度，剩余樣本置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.1.2 突變型質(zhì)粒

使用重疊延伸法構(gòu)建突變型質(zhì)粒，包括表1中的7種熱點(diǎn)突變.使用小量質(zhì)粒提取試劑盒(Omega，美國(guó))提取質(zhì)粒，使用BamH Ⅰ酶(TaKaRa，大連)酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳切膠獲得對(duì)應(yīng)長(zhǎng)度的目的片段，用膠回收試劑盒(Omega，美國(guó))純化得到線性質(zhì)粒，用Spectrophotometer ND-1000測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度，根據(jù)濃度及質(zhì)粒片段大小計(jì)算出對(duì)應(yīng)拷貝數(shù)，梯度稀釋后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.1.3 引物和探針

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢公布的Kras序列，查找到相關(guān)序列并標(biāo)出單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，在后續(xù)的引物和探針設(shè)計(jì)過(guò)程中保證引物探針位置不覆蓋SNP位點(diǎn)，以免影響擴(kuò)增效率或雜交效率.

由于所檢測(cè)的7個(gè)突變集中在密碼子12和13上，設(shè)計(jì)一條探針即可全部覆蓋.為了增強(qiáng)探針對(duì)野生型和突變型的區(qū)分度，依據(jù)反義序列設(shè)計(jì)探針，使探針與野生型完全匹配.使用TmUtility v1.3軟件預(yù)測(cè)探針與野生型和突變型雜交雙鏈的Tm值，保證兩者的ΔTm大于5 ℃.使用The Mfold Web Server(http:∥mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，保證設(shè)計(jì)的改良分子信標(biāo)僅存在一種穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，分析條件為Na+濃度50 mmol/L、Mg2+濃度3.0 mmol/L、折疊溫度55 ℃.未修飾的探針設(shè)計(jì)完成后，結(jié)合Kras突變特點(diǎn)進(jìn)行LNA修飾，7個(gè)熱點(diǎn)突變發(fā)生在密碼子12和13的3個(gè)堿基G位點(diǎn)上，對(duì)這3個(gè)位點(diǎn)的核苷酸進(jìn)行LNA修飾.通過(guò)LNA TM Oligo Tools(https:∥www.exiqon.com/oligo-tools)預(yù)測(cè)修飾LNA后探針的Tm值.

綜上所述，在抑制HeLa細(xì)胞中的GRIM-19基因表達(dá)后，細(xì)胞的存活及抗凋亡作用能力顯著降低，提示GRIM-19基因?qū)δ[瘤細(xì)胞起到了保護(hù)作用。深入研究GRIM-19基因在子宮頸癌中的表達(dá)和意義將會(huì)為今后的臨床治療和防治提供重要的理論基礎(chǔ)。

探針設(shè)計(jì)完成后，使用Primer Premier 5.0、Oligo 6.0和TmUtility v1.3軟件在探針兩側(cè)設(shè)計(jì)引物.將設(shè)計(jì)好的引物和探針通過(guò)BLAST(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比對(duì)，保證其擴(kuò)增和檢測(cè)的特異性.引物和探針均由上海生物工程有限公司合成，相應(yīng)序列見(jiàn)表2.

表2 MCA-LNA體系所用引物和探針

注：“+”后的堿基表示其被相應(yīng)的LNA替代.

1.2 方 法

1.2.1 人工合成靶序列MCA考察探針

人工合成的靶序列是一段與探針互補(bǔ)的寡核苷酸，比探針長(zhǎng)約4～8 bp，用于考察探針的區(qū)分能力和評(píng)價(jià)LNA修飾對(duì)探針Tm值和ΔTm的影響.合成的8條靶序列如表3所示.

表3 本研究所用的人工合成靶序列

注：下劃線標(biāo)記位置為突變位點(diǎn).

探針與人工合成靶序列的MCA體系(25 μL)如下：1×PCR緩沖液、0.2 μmol/L探針、0.4 μmol/L靶序列或無(wú)菌水(陰性對(duì)照).MCA程序?yàn)椋?5 ℃變性1 min，35 ℃保溫5 min，隨后按照每步0.2 ℃的升溫速率從40 ℃遞增至95 ℃，升溫過(guò)程中采集ROX通道的熒光信號(hào).實(shí)驗(yàn)在LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)上進(jìn)行.

1.2.2 MCA-LNA體系的建立

MCA-LNA體系(25 μL)如下：1×PCR緩沖液、5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.5 UTaqHS(TaKaRa，大連)、0.4 μmol/L上游引物、0.04 μmol/L下游引物、0.2 μmol/L探針和5 μL DNA模板.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min;循環(huán)周期為95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，78 ℃ 10 s，共60個(gè)循環(huán).PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行探針MCA，分析程序與1.2.1小節(jié)中相同.

1.2.3 體系的分析靈敏度考察

靈敏度為在一定量野生型背景下能夠檢測(cè)到的突變模板含量.3.3 pg人類基因組DNA相當(dāng)于1個(gè)拷貝[16]，即10 ng相當(dāng)于3×103個(gè)拷貝.考察MCA-LNA體系的分析靈敏度時(shí)，使用相同濃度(6×103拷貝/μL)的突變型質(zhì)粒DNA和野生型基因組DNA按不同比例混合，形成一系列混合模板，突變型比例分別為50%，10%，5%，1%，0.5%，0.1% 和0.05%.

1.2.4 結(jié)直腸癌臨床標(biāo)本檢測(cè)

通過(guò)對(duì)72份結(jié)直腸癌臨床冰凍組織標(biāo)本的檢測(cè)，考察MCA-LNA體系的準(zhǔn)確性和臨床適用性.同時(shí)采用MCA體系、直接測(cè)序和本研究前期建立的ARMS[17]作為對(duì)照方法對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證.

2 結(jié)果與分析

2.1 MCA-LNA體系檢測(cè)原理

MCA技術(shù)檢測(cè)突變的原理如下：當(dāng)探針設(shè)計(jì)與野生型序列完全匹配時(shí)，探針與野生型擴(kuò)增子形成完全匹配且穩(wěn)定的雙鏈產(chǎn)物，產(chǎn)生Tm值較高的熔解峰；而探針與突變型擴(kuò)增子會(huì)產(chǎn)生單堿基錯(cuò)配，形成穩(wěn)定性較差的雙鏈產(chǎn)物，產(chǎn)生Tm值較低的熔解峰.MCA-LNA檢測(cè)體系采用LNA修飾探針進(jìn)行MCA,與MCA體系檢測(cè)原理類似:由于完全匹配的DNA-LNA雙鏈穩(wěn)定性顯著高于DNA-DNA雙鏈，所以探針與野生型模板形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，在延伸階段也可穩(wěn)定結(jié)合，導(dǎo)致引物難以延伸，從而起到抑制野生型模板擴(kuò)增的作用；而探針與突變型模板間有單堿基突變，相對(duì)于DNA-DNA雙鏈，DNA-LNA雙鏈存在錯(cuò)配會(huì)更大程度地降低雙鏈穩(wěn)定性，在延伸階段探針可以解鏈，使得突變型模板的擴(kuò)增不受影響，以此達(dá)到富集突變型模板的目的.

2.2 靶序列的MCA考察

靶序列的熔解曲線如圖1(a)和(b)所示：探針與野生型模板完全匹配，所得雙鏈產(chǎn)物的Tm值最高；探針與7個(gè)突變型模板均有一個(gè)堿基錯(cuò)配，所得雙鏈產(chǎn)物的Tm值較低，且探針在LNA修飾前后均可達(dá)到區(qū)分野生型和突變型的目的.不同模板對(duì)應(yīng)的Tm值如圖1(c)所示，可見(jiàn)LNA修飾探針后，7種突變型和野生型模板的Tm值均得到明顯提升，提升幅度在7～10 ℃.探針熔解曲線的區(qū)分能力取決于野生型與突變型的ΔTm值.如圖1(d)所示，LNA修飾后探針的ΔTm提高約1～4 ℃,由此可見(jiàn)LNA修飾能提升探針的區(qū)分能力.

(a)和(b)分別為MCA-LNA和MCA體系的探針與靶序列的熔解曲線，WT為野生型對(duì)照，NTC為無(wú)模板對(duì)照，MUT為突變型模板，F(xiàn)表示熒光強(qiáng)度(下同)；(c)野生型與不同突變型的Tm值對(duì)比；(d)不同突變型與野生型之間的ΔTm值對(duì)比.圖1 靶序列的MCAFig.1 MCA of target sequences

2.3 分析靈敏度的考察

MCA-LNA體系的靈敏度考察結(jié)果如圖2所示:靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品由于混有野生型和突變型2種模板，所以會(huì)有2個(gè)不同Tm值的熔解峰;以突變型峰的有無(wú)作為判讀依據(jù)，MCA-LNA體系的分析靈敏度可達(dá)0.05%～0.5%.由此可見(jiàn)MCA-LNA體系具有良好的檢測(cè)靈敏度，更適用于腫瘤的稀有突變檢測(cè).

2.4 臨床標(biāo)本檢測(cè)

MCA-LNA體系檢測(cè)結(jié)直腸癌標(biāo)本的結(jié)果顯示，72份標(biāo)本中檢測(cè)出24份陽(yáng)性，突變率為33.3%，與文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道的突變率一致.

典型臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示：其中33號(hào)和51號(hào)標(biāo)本經(jīng)測(cè)序檢測(cè)均為突變型，且51號(hào)標(biāo)本中突變型的比例較33號(hào)的低，用MCA體系檢測(cè)時(shí)，突變型比例較高的標(biāo)本，其突變信號(hào)峰也較高，而MCA-LNA體系對(duì)這2份標(biāo)本檢測(cè)的突變型信號(hào)峰均更明顯；對(duì)于67號(hào)標(biāo)本，測(cè)序和MCA體系均未檢出突變型，但MCA-LNA體系檢測(cè)時(shí)有較低的突變型信號(hào)峰，說(shuō)明MCA-LNA體系更有利于低比例突變型標(biāo)本的檢測(cè).

全部標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4.由于測(cè)序的靈敏度只能達(dá)到15%～20%，檢測(cè)標(biāo)本時(shí)容易造成假陰性，24份陽(yáng)性標(biāo)本中測(cè)序僅檢測(cè)到15份突變陽(yáng)性；MCA體系檢測(cè)時(shí)，相比MCA-LNA體系少檢出5份陽(yáng)性標(biāo)本，其余檢測(cè)結(jié)果完全一致；ARMS檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)到26份突變陽(yáng)性標(biāo)本，相比MCA-LNA體系多檢出2份G12V陽(yáng)性標(biāo)本(10號(hào)和18號(hào))，分析其檢測(cè)結(jié)果不一致的原因?yàn)锳RMS對(duì)該位點(diǎn)的檢測(cè)靈敏度(0.01%)略高于MCA-LNA體系對(duì)該位點(diǎn)的靈敏度(0.05%)，當(dāng)樣本中突變型比例在0.05%以下時(shí)，MCA-LNA在該位點(diǎn)可能存在突變型標(biāo)本漏檢的情況.

圖2 MCA-LNA體系的分析靈敏度Fig.2 Analytical sensitivity of MCA-LNA assay

圖3 典型臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection results of typical clinical samples

以上結(jié)果說(shuō)明標(biāo)本檢出的突變陽(yáng)性率與分析靈敏度的高低有關(guān)，MCA-LNA體系的探針經(jīng)LNA修飾后提升了檢測(cè)的靈敏度，從而提高了突變陽(yáng)性標(biāo)本的檢出率.

3 討論與結(jié)論

Kras突變檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌患者的個(gè)體化治療有非常重要的作用.然而Kras突變屬于實(shí)體瘤中體細(xì)胞的稀有突變，對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法造成了技術(shù)瓶頸，因此要求檢測(cè)的靈敏度必須得到很大程度的提升，以避免檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性，提高稀有突變的檢出率.

表4 不同方法的樣本檢測(cè)結(jié)果

注：WT.野生型；MUT.突變型.

LNA對(duì)DNA的親和性高且區(qū)分度良好，在PCR反應(yīng)過(guò)程中不會(huì)被DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性所影響，可以富集突變型，提高體系的靈敏度.目前LNA技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于低豐度突變的檢測(cè)中，利用與野生型完全匹配的LNA修飾的寡核苷酸鏈作為阻抑子阻礙野生型模板的擴(kuò)增，可實(shí)現(xiàn)對(duì)突變型模板的富集.例如利用LNA技術(shù)對(duì)低豐度突變富集后測(cè)序[20-21]，靈敏度達(dá)到約1%，富集能力達(dá)到普通MCA體系的約20倍；利用LNA技術(shù)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)[22-24]時(shí)，在PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入LNA阻抑子和熒光檢測(cè)探針，靈敏度約為0.1%.本研究對(duì)MCA體系中的熒光雙標(biāo)記自淬滅探針進(jìn)行LNA修飾，使探針同時(shí)作為阻抑子和檢測(cè)探針，既在擴(kuò)增階段達(dá)到阻抑野生型和富集突變型的目的，又在MCA時(shí)作為檢測(cè)探針對(duì)多種突變型與野生型進(jìn)行區(qū)分，體系的靈敏度可達(dá)0.05%～0.5%，與普通MCA體系相比，LNA修飾后體系的突變富集能力可達(dá)10～100倍.

MCA-LNA體系存在的缺點(diǎn)是無(wú)法區(qū)分Kras突變的類型，但由于Kras多種突變類型對(duì)EGFR靶向藥物都是耐藥的，所以不會(huì)影響耐藥情況的判斷.近年來(lái)有研究顯示，含有不同Kras突變的患者可能會(huì)有不同的臨床反應(yīng)：若攜帶有KrasG12D突變，則可能發(fā)生造血系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移[25]；若發(fā)生Kras密碼子13的突變，同時(shí)MACC1基因高表達(dá)，則患者生存期會(huì)減短[26]；若發(fā)生KrasG12C或G13D突變，則預(yù)后會(huì)變差[27].這些研究說(shuō)明Kras突變類型的區(qū)分也是有意義的，但目前還未得到廣泛認(rèn)證.若檢測(cè)中需要進(jìn)行突變類型的確認(rèn)，可將MCA-LNA體系的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，輔助判讀.

綜上，本研究以MCA體系為基礎(chǔ)，結(jié)合LNA修飾探針技術(shù)建立了MCA-LNA體系.與普通MCA體系相比，通過(guò)探針的改良達(dá)到了富集突變型的效果，提高了分析靈敏度，實(shí)現(xiàn)一管反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)Kras密碼子12和13上的7個(gè)熱點(diǎn)突變.此方法判讀簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本較低，具有良好的臨床推廣潛力.