任子顧，許保海

老年人在衰老及諸多基礎性疾病的作用下，機體逐漸進入至各項功能自然衰退期。氧化自由基水平異常升高為機體衰老、諸多退行性病變的重要誘因。衰老可引起氧化自由基代謝障礙，對膽堿能系統(tǒng)造成損傷，誘發(fā)大腦海馬神經元、皮質結構等發(fā)生異常改變，造成陳述性記憶功能受損，并可逐漸進展為阿爾茨海默癥(alzheimer’s disease，AD)[1-3]。因此，阻斷或延緩這一進程對于抗衰老、改善老年人記憶功能及預防AD均具有重要意義。然而，目前臨床上對于這一進程尚無特效藥物，西藥治療本病療效欠佳，且因副作用較大，長期應用患者耐受度較低。遠志中醫(yī)常用的益智類藥物，其主要成分為遠志皂苷、寡糖脂類等活性物，具有改善記憶力、抗氧化、抗衰老、抗炎及保護神經等功效。遠志提取物具有改善AD小鼠模型學習記憶功能及減少腦β淀粉樣蛋白積聚的功效，但其作用機制尚未能完全明晰[4-6]。目前，臨床上關于遠志改善AD患者及動物模型記憶、認知功能等的研究較多，但正常衰老相關的研究較少。因此，本研究以老年大鼠為觀察資料，客觀評估遠志提取物對老年大鼠記憶功能的作用，以及其對老年大鼠大腦海馬體、皮質氧化自由基代謝的影響。

1材料與方法

1.1 材料 由中國醫(yī)科大學動物部提供24只24月齡的老年Wistar大鼠，隨機分為2組，老年非用藥組、老年用藥組，每組12只，另選取12只6月齡的青年大鼠為對照組，全部大鼠均為雄性。對照組大鼠體重為150～210g，平均(182.65±5.64)g，老年非用藥組大鼠體重為380～490 g，平均(435.17±2.31)g，老年用藥組大鼠體重為370～510 g，平均(436.12±2.47)g。老年大鼠體重高于青年大鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，2組老年大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義。

遠志購自于同仁堂中藥飲片公司。提取物制備，按遠志體積分數75%量取乙醇進行浸泡，后以超聲破碎，過濾殘渣后使用茄型瓶旋蒸，獲得膏狀提取物。使用時以聚乙二醇加蒸餾水充分溶解。

一氧化氮(nitric oxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒及硫代巴比妥酸均購自上海酶聯生物科技公司。SPECTRUM、SP-2000UV紫外線可見光光度計購自上海光譜儀器公司。水迷宮實驗視頻分析系統(tǒng)購自成都泰盟軟件公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 干預方法 老年非用藥組與對照組均不予任何干預，正常喂養(yǎng)，自由食水自由活動3個月。老年用藥組給予遠志提取物溶液200 μl，其中遠志提取物含量為200 mg/kg，灌胃，1次/d，維持3個月。

1.2.2 記憶功能 采用Morris水迷宮實驗[7]評估。干預3個月后，行 Morris水迷宮實驗，在訓練泳池水中加入牛奶使水質渾濁，水溫控制在22 ℃左右。水池劃分為東、南、西、北4個象限，將平臺置于某1個象限中央，使池水沒過平臺約3 cm。第1-5天行定位航行訓練，第1天將各組實驗動物放入池中游泳120 s適應水池環(huán)境；第2天于某1個象限內置入平臺，將實驗動物按順序從各象限朝池壁方向放入池水中，開始獲得訓練，記錄大鼠尋找到平臺的用時，逃避潛伏期設置為120 s，將120 s內未能尋找平臺的大鼠引導至平臺停留10 s，1次/d，連續(xù)訓練5 d，第5天訓練結束時為結果數據。定位航行實驗結束后24 h，除去平臺，開展空間搜索實驗，記錄全部大鼠120 s內穿越平臺位置的次數、在平臺象限的停留時間、平臺直徑2倍范圍的有效區(qū)內停留時間、游泳總路程。實驗全程共計6 d，1次/d。

1.2.3 氧化自由基代謝 以NO、MDA、SOD、CAT水平為氧化自由基代謝評估指標。于全部實驗結束后24 h內，處死全部大鼠，斷頭取腦，使用0 ℃生理鹽水進行沖洗，迅速分離海馬體與大腦皮質。于0 ℃條件下超聲粉碎海馬體與大腦皮質組織，制備為100 g/L的組織勻漿；溫度4 ℃，3000 r/min，離心15 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱儲存待檢。按硫代巴比妥酸法檢測上述上清液中NO、MDA、SOD、CAT水平。

1.2.4 組織學檢查及細胞計數 斷頭取腦，用甲醛溶液固定，制作石蠟切片，內氏體染色，光鏡下觀察海馬細胞形態(tài)變化。行常規(guī)石蠟包埋、切片，H-E染色，細胞計數1 mm2(×50)取雙側海馬細胞數的均值。

2 結 果

2.1 水迷宮試驗 各組水迷宮試驗結果數據差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步對比，對照組青年大鼠第5天逃避潛伏期、穿越平臺次數、平臺象限停留時間、有效區(qū)停留時間、游泳路程均優(yōu)于其他各組，其次為老年用藥組，老年用藥組優(yōu)于老年非用藥組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

2.2 海馬氧化自由基代謝指標 各組大鼠海馬體NO、MDA、SOD、CAT水平差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步對比，對照組青年大鼠海馬組織NO、MDA、SOD、CAT水平均優(yōu)于其他各組，其次為老年用藥組，老年用藥組優(yōu)于老年非用藥組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

指標對照組老年非用藥組老年用藥組FP第5天逃避潛伏期(s)24.05±3.4747.15±4.71①31.11±4.06①②187.6310.000穿越平臺次數(次)4.75±0.482.69±0.36①3.45±0.61①②58.3870.000平臺象限停留時間(s)40.10±5.2423.16±4.92①34.76±5.00①②36.3940.000有效區(qū)停留時間(s)16.99±1.3010.34±0.86①14.85±0.93①②198.2540.000游泳路程(cm)313.57±16.29203.65±14.02①291.54±14.82①②185.4360.000

注：與對照組比較，①P<0.05；與老年非用藥組比較，②P<0.05

指標對照組老年非用藥組老年用藥組FPNO(μmol/g)39.15±5.2994.85±7.02①47.33±6.47①②239.1960.000MDA(μmol/g)16.73±1.7731.64±5.43①20.23±4.22①②43.4780.000SOD(μU/g)114.06±6.0139.15±4.58①91.58±5.13①②625.1870.000CAT(U/mg)5.18±0.752.03±0.79①4.09±0.88①②56.4380.000

注：與對照組比較，①P<0.05；與老年非用藥組比較，②P<0.05

2.3 大腦皮質氧化自由基代謝指標 各組大鼠大腦皮質NO、MDA、SOD、CAT水平差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；進一步對比，對照組青年大鼠大腦皮質組織NO、MDA、SOD、CAT水平均優(yōu)于其他各組，其次為老年用藥組，老年用藥組優(yōu)于老年非用藥組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

指標對照組老年非用藥組老年用藥組FPNO(μmol/g)38.03±4.1369.68±7.28①45.53±5.17①②147.1830.000MDA(μmol/g)14.98±1.9428.74±5.37①19.40±4.4①②36.5270.000SOD(μU/g)121.25±7.0242.19±5.27①95.45±4.54①②597.5140.000CAT(U/mg)6.18±0.813.04±0.65①5.18±0.82①②67.5020.000

注：與對照組比較，①P<0.05；與老年非用藥組比較，②P<0.05

2.4 各組大鼠海馬形態(tài)學觀察結果及計數比較 對照組大鼠海馬錐體細胞層結構緊密，層次豐富。老年非用藥組海馬錐體細胞排列稀疏，細胞線變得不清晰。老年用藥組海馬錐體細胞線清晰，明顯優(yōu)于老年非用藥組。對照組錐體細胞核大、染色淺、細胞質豐富、細胞排列緊密。老年非用藥組形態(tài)正常的細胞數明顯減少，細胞結構不完整，細胞核固縮，有的形成碎片。細胞質內內氏體減少，細胞排列稀疏、形態(tài)異常。老年用藥組細胞排列緊密、數量明顯增多，內氏體豐富，僅見少數細胞變性。單位面積細胞計數分別為對照組(152.21±17.34)、老年非用藥組(72.23±23.38)、老年用藥組(138.27±24.97)，3組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

隨著我國社會老齡化結構逐漸加深，全社會對于抗衰老課題亦日漸重視。自由基損傷誘導衰老理論目前已經達成廣泛共識。人體內的諸多自由基可隨年齡增長而積聚，特別是過度的氧自由基可誘發(fā)神經元細胞損傷與凋亡，從而導致記憶功能、認知能力等衰退。人體的大腦與其他重要器官相比，抗氧化的能力相對更為羸弱，對于氧化損傷具有高度敏感性，自由基的過度積累可逐步形成海馬神經元的變性，造成認知功能減退。學習、記憶功能為腦部高級功能，學習記憶功能衰退標志著腦功能的全面退化，為腦衰老的一項重要表現。氧化應激反應為腦衰老相關神經功能退行性病變的一項重要誘因。因此，拮抗氧自由基相關損傷已經成為了防治腦衰老相關疾病的新途徑。腦組織中的NO、MDA、SOD、CAT含量均為腦細胞中脂質過氧化程度與細胞損傷的重要監(jiān)測指標。正常健康狀態(tài)下，機體所產生的氧自由基及其清除系統(tǒng)保持動態(tài)平衡，一旦這一平衡機制發(fā)生紊亂，作為主要抗氧化酶活性物質SOD的水平下降，氧自由基過度積聚，形成氧化應激性損傷，使體內脂質的過氧化物MDA水平上升，久之誘發(fā)細胞膜的損傷，組織器官的功能受損，機體各器官功能進入至衰退期[8-10]。過度氧自由基損傷為老年性癡呆、AD、認知功能障礙等諸多神經退行性病變的一項重要誘因與致病基礎[11，12]。因此，清除過度氧自由基為延緩衰老、預防衰老相關腦疾病的一項重要措施。

眾所周知，抗衰老為人類一貫致力研究的重要課題，但目前仍尚未發(fā)現特效方法，我國中醫(yī)學在這一領域擁有悠久歷史與豐富經驗。中醫(yī)學理論認為，腦衰老是因腦髓失養(yǎng)引發(fā)，《醫(yī)林改錯》中指出，年高者記性漸減，因腦髓漸空所致[13]，且患者多因痰濕上擾心神而使神智失節(jié)。因此治療中應選用益智、祛痰類藥物。遠志為中醫(yī)學臨床上常用的益智類藥物，其為多年生草本植物，具有益智安神、祛痰消腫等功效，主要應用于神忡智昏、驚悸健忘、神志恍惚、心腎不交導致的失眠多夢等癥的臨床治療中[14，15]。

本研究采用動物模式研究了遠志對老年大鼠記憶功能的改善作用，及其對大鼠海馬、腦皮質氧化自由基代謝的影響。本研究選用青年大鼠作為對照組，另將老年大鼠分別納入不進行任何干預的老年非用藥組以及以遠志干預的老年用藥組。通過實驗，對照組大鼠水迷宮各項試驗結果均優(yōu)于各老年大鼠組，在老年大鼠中老年用藥組優(yōu)于老年非用藥組。由此可知，老年大鼠存在明確的記憶功能衰退，經遠志干預后可改善老年大鼠的記憶功能，但3個月的干預期內未能達到健康青年大鼠水平。對各組大鼠腦部海馬、皮質組織進行化驗對比的結果表明，對照組青年大鼠海馬與大腦皮質組織中NO、MDA、SOD、CAT水平均優(yōu)于老年大鼠，在老年大鼠中老年用藥組優(yōu)于老年非用藥組。由此可知，遠志能夠改善老年大鼠海馬、皮質組織中氧化自由基的代謝功能，提高過氧化物清除能力，但仍未能達到健康青年大鼠的清除能力。本研究亦發(fā)現，遠志提取物能夠改善老年用藥組的細胞形態(tài)，單位面積細胞計數較老年非用藥組更佳，但亦不及對照組。延長遠志的應用時間是否可進一步擴大上述功能有待于進一步研究。

綜上所述，遠志提取物能夠改善老年大鼠記憶功能，這一改善功效主要與遠志有效改善海馬區(qū)細胞形態(tài)，提高了老年大鼠腦海馬、皮質組織中氧化自由基代謝功能，增強了腦部過氧化物清除能力的機制相關。