張樹東，周 建，田 壯，劉長(zhǎng)振，姚 琦

骨質(zhì)疏松是老年人的常見病和多發(fā)病，嚴(yán)重影響著老年人的生活質(zhì)量。目前，與核因子κ-B配體的受體激活劑(receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand，RANKL)和骨硬化蛋白相關(guān)的免疫療法在骨質(zhì)疏松治療上取得一定進(jìn)展[1-2]。我們課題組欲通過將RANKL、骨硬化蛋白與Qβ病毒樣顆粒(Qβvirus-like particles，Qβ-VLPs)交聯(lián)制備骨質(zhì)疏松相關(guān)疫苗的方式，達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的目的。Qβ-VLPs能誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答，在疫苗領(lǐng)域中研究很廣泛，現(xiàn)已經(jīng)與相應(yīng)抗原交聯(lián)制備出瘧疾疫苗[3]、腫瘤疫苗[4]、寨卡病毒疫苗[5]、骨質(zhì)疏松疫苗[6]，并且戒煙疫苗、高血壓疫苗等已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，表現(xiàn)出很好的安全性，表明Qβ-VLPs具有很大的應(yīng)用于人體疫苗制備的研究潛力[7-8]。

表達(dá)并制備具有正確空間結(jié)構(gòu)且純度較高的Qβ-VLPs是將其用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，Tatyana等[9]通過反轉(zhuǎn)錄等技術(shù)獲得編碼Qβ衣殼蛋白的基因C，并獲得電鏡下與野生型球形結(jié)構(gòu)相似的Qβ-VLPs。基因C由編碼Qβ衣殼蛋白的133個(gè)氨基酸(14 ku)和編碼通讀蛋白A1的329個(gè)氨基酸組成，A1蛋白會(huì)有部分代替衣殼蛋白單體形成180聚體顆粒[10]，在形成感染性噬菌體顆粒中發(fā)揮著重要作用[11]。本課題組設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行Qβ-VLPs蛋白表達(dá)、鑒定和純化，以獲得更為安全的Qβ-VLPs。

1 材料與方法

1.1 設(shè)計(jì) 優(yōu)化病毒樣顆粒蛋白的表達(dá)及純化條件。

1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2017-06至2018-12在中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 材料

1.3.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌感受態(tài)DH5α、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)均購自天根生化科技 (北京) 有限公司，查閱文獻(xiàn)[9]獲得Qβ衣殼蛋白的序列全長(zhǎng)，共402 bp，編碼133個(gè)氨基酸，由北京普爾普樂生物科技有限公司克隆到載體質(zhì)粒pET-30a上，記為pET-30a-Qβ-VLPs。

1.3.2 試劑及儀器 質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技 (北京) 有限公司，卡那霉素、氯霉素購自北京索萊寶科技有限公司，0.45 μm濾器購自美國Millipore公司，蛋白Marker購自美國賽默飛公司，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購自寧波新芝生物科技股份有限公司，恒溫振蕩器購自上海一恒公司，AKTA avant 25蛋白層析純化系統(tǒng)和CL-4B分子篩填料購自美國GE公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 目的質(zhì)粒的擴(kuò)增及小量提取 取出合成的pET-30a-Qβ-VLPs質(zhì)粒，根據(jù)說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5α中，取出適量菌液涂布到帶有卡那霉素(100 μg/ml)抗性的固體LB培養(yǎng)液上，倒置放置于37 ℃恒溫箱過夜培養(yǎng)。挑取單菌落擴(kuò)增，送生物公司測(cè)序。依據(jù)小提質(zhì)粒試劑盒說明書的要求提取pET-30a-Qβ-VLPs質(zhì)粒并于-20 ℃冰箱備用。

1.4.2 Qβ-VLPs蛋白的表達(dá)和鑒定 (1)pET-30a-Qβ-VLPs質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)使用常用的原核蛋白表達(dá)菌株BL21(DE3)并不能得到具有球形結(jié)構(gòu)的Qβ-VLPs，因此本實(shí)驗(yàn)使用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)三種菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。依據(jù)感受態(tài)說明書將pET-30a-Qβ-VLPs質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到3種菌株中，然后涂布到添加有相應(yīng)抗菌素的LB固體培養(yǎng)液上過夜培養(yǎng)，其中BL21(DE3)菌株使用添加有卡那霉素(100 μg/ml)的固體LB培養(yǎng)液，BL21(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)菌株使用添加有卡那霉素(100 μg/ml)+氯霉素(25 μg/ml)的固體LB培養(yǎng)液。(2)菌株的誘導(dǎo)表達(dá)。從過夜培養(yǎng)的固體LB培養(yǎng)液上挑取單菌落，在添加有相應(yīng)抗菌素的LB培養(yǎng)液中擴(kuò)增(37 ℃，220 r/min)，待菌液濃度達(dá)到OD：0.6～0.8時(shí)，從3種不同的菌液中各取0.5 ml作為空白對(duì)照，然后向3種菌液中加入蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑IPTG使其終濃度為0.5 mM，在16 ℃、180 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h。(3)SDS-PAGE分析Qβ-VLPs蛋白。離心收集表達(dá)后的菌體，并用雙蒸水清洗菌體一次。向3種菌株誘導(dǎo)前、后的樣品中加入適量的還原型蛋白上樣緩沖液，在金屬浴中100 ℃加熱5 min，通過使用12%的SDS-PAGE檢測(cè)3種菌株是否能表達(dá)Qβ-VLPs的單體。(4)SDS-PAGE和透射電鏡驗(yàn)證Qβ-VLPs蛋白結(jié)構(gòu)。Qβ-VLPs以180聚體的形式存在，穩(wěn)定的5-6聚體是其基本單位，能檢測(cè)出5-6聚體的存在形式，基本可確定Qβ-VLPs球形結(jié)構(gòu)的形成。取出3種誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體沉淀并用超聲破碎，離心收集上清液，用非還原性蛋白電泳上樣緩沖液處理樣品，并用SDS-PAGE檢測(cè)是否形成Qβ-VLPs的5-6聚體。用5%的磷鎢酸對(duì)3種Qβ-VLPs上清液進(jìn)行染色后用透射電鏡觀察是否表達(dá)出球形結(jié)構(gòu)。

1.4.3 BL21(DE3)pLysS菌株表達(dá)條件的優(yōu)化 筆者通過BL21(DE3)pLysS表達(dá)出具有球形結(jié)構(gòu)的Qβ-VLPs，然后設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化其表達(dá)效率，IPTG在原核表達(dá)中發(fā)揮著重要作用，本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置0.2 mM和0.5 mM兩個(gè)IPTG濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按上述步驟將菌體分為2組進(jìn)行擴(kuò)增，待菌液OD達(dá)到0.6～0.8時(shí)暫停搖床，向菌液中滴加IPTG，使得第1組工作濃度為0.2 mM，第2組工作濃度為0.5 mM，誘導(dǎo)表達(dá)20 h，條件為16 ℃，180 r/min。培養(yǎng)結(jié)束后超聲破碎菌體并離心收集蛋白上清液，用非還原性蛋白上樣緩沖液處理后SDS-PAGE驗(yàn)證。

1.4.4 菌體破碎方式的優(yōu)化 Qβ-VLPs具有一定的空間結(jié)構(gòu)，不同的菌體破碎方式對(duì)蛋白產(chǎn)量存在一定的影響，本實(shí)驗(yàn)采用3種不同的菌體破碎方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每種方式使用等量的相同表達(dá)條件的菌體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(1)超聲破菌：取出凍存的菌體，用10 ml的PBS沖懸后，使用超聲儀冰浴條件下破菌，超聲破菌功率300 W，破碎3 s，間歇5 s，共20 min。破碎結(jié)束后4 ℃，12 000 r/min，離心30 min，棄去沉淀，收集上清。(2)反復(fù)凍融破菌：取出凍存的菌體，室溫融化，然后向其中加入適量液氮至菌體全部凝固，室溫放置至菌體融化，然后再次加入適量液氮，重復(fù)該過程5次。操作結(jié)束后用10 ml的PBS沖懸菌體，離心取上清，棄沉淀。(3)溶菌酶裂解：用PBS溶液(含有2 mg/ml溶菌酶和0.1%Triton X 100)沖懸菌體，室溫放置30 min，間歇吹打混勻，然后用20 ml注射器反復(fù)吹打破碎菌體。操作結(jié)束后離心取上清，棄沉淀。操作結(jié)束后將得到的3組蛋白上清液用0.45 μm濾膜過濾，取適量樣品用非還原性蛋白上樣緩沖液處理后SDS-PAGE驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4.5 Qβ-VLPs蛋白的純化 取適量菌體超聲破菌后4 ℃，12 000 r/min，離心20 min收集上清。(1)硫酸銨聚沉：向蛋白上清液中添加硫酸銨至終濃度為20%，4 ℃層析柜靜置4 h后離心收集上清。再調(diào)整硫酸銨至終濃度為50%，4 ℃層析柜靜置過夜，離心收集沉淀，棄去上清；(2)高速離心除沉淀：將硫酸銨聚沉得到的蛋白沉淀用適量PBS溶解后高速離心，離心條件：4 ℃，20 000 r/min，離心60 min。離心結(jié)束后，收集上清液；(3)分子篩蛋白純化：將高速離心后得到的Qβ-VLPs上清液用10 kDa的濃縮管離心濃縮至1 ml，使用分子篩通過AKTA系統(tǒng)進(jìn)行純化，分段收集樣品后透射電鏡和SDS-PAGE驗(yàn)證結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 不同菌株表達(dá)Qβ-VLPs結(jié)果 SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明，3種菌株均能表達(dá)Qβ衣殼蛋白單體，其中，只有BL21(DE3)pLysS菌株可以表達(dá)出具有5-6聚體的結(jié)構(gòu)(圖1，只提供BL21(DE3)pLysS菌株電泳結(jié)果)。透射電鏡觀察，只有BL21(DE3)pLysS菌株可以表達(dá)具有25～30 nm球形結(jié)構(gòu)的Qβ-VLPs(圖2)。

圖1 SDS-PAGE檢測(cè)BL21(DE3)pLysS菌株表達(dá)結(jié)果

用非還原性(non-reducing)蛋白上樣緩沖液處理樣品后，用12%的SDS-PAGE檢測(cè)樣品中Qβ病毒樣顆粒的結(jié)果。圖中箭頭分別表示單體、二聚體、五聚體和六聚體

圖2 電鏡觀察不同菌株表達(dá)Qβ-VLPs的結(jié)果

A. BL21(DE3)菌株; B. BL21(DE3)pLysS菌株; C. Rosetta(DE3)菌株

2.2 Qβ-VLPs表達(dá)條件的優(yōu)化 SDS-PAGE檢測(cè)，0.5 mM的IPTG時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)效率較高，是0.2 mM的2.8倍(圖3)。

圖3 SDS-PAGE檢測(cè)不同IPTG濃度對(duì)Qβ-VLPs表達(dá)影響

設(shè)置2個(gè)不同的IPTG濃度分別對(duì)Qβ病毒樣顆粒蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，觀察對(duì)Qβ病毒樣顆粒表達(dá)的影響。圖中a表示0.2 mM的IPTG濃度，b表示0.5 mM的IPTG濃度

2.3 菌體破碎方式對(duì)蛋白產(chǎn)量和純度的影響 超聲破碎所得蛋白產(chǎn)量是溶菌酶法的1.1倍，是反復(fù)凍融法的3.5倍(圖4)。

圖4 SDS-PAGE檢測(cè)菌體破碎方式對(duì)Qβ-VLPs蛋白產(chǎn)量的影響

2.4 Qβ-VLPs的純化結(jié)果 取破碎后分離得到的Qβ-VLPs上清液經(jīng)硫酸銨、高速離心進(jìn)行初步純化，然后用分子篩分離(圖5A)。收集50～100 ml之間的蛋白用透射電鏡和SDS-PAGE檢測(cè)，可以得到純度在90%左右、電鏡下呈球形結(jié)構(gòu)的Qβ-VLPs(圖5B)。

圖5 Qβ-VLPs的純化及檢測(cè)

3 討 論

Qβ-VLPs具有很好的安全性和打破機(jī)體免疫耐受的功能，在疫苗研究領(lǐng)域具有很大的發(fā)展?jié)摿?。A1蛋白作為Qβ噬菌體中的通讀蛋白，與Qβ衣殼蛋白共用起始密碼子，可代替部分衣殼蛋白單體形成180聚體的病毒樣顆粒[10]，但是，A1在形成感染性噬菌體顆粒中發(fā)揮著重要作用[11]。既能得到Qβ衣殼蛋白形成的病毒樣顆粒，又能避免A1潛在的感染性威脅，是本實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹?。本?shí)驗(yàn)只把Qβ噬菌體基因C中的Qβ衣殼蛋白的基因克隆到載體質(zhì)粒pET30a上，不包含Qβ衣殼蛋白終止密碼子后的基因序列，不能合成通讀蛋白A1。筆者發(fā)現(xiàn)使用A1蛋白和Qβ衣殼蛋白二者存在的條件下表達(dá)病毒樣顆粒的方法，與僅有Qβ衣殼蛋白時(shí)組裝病毒樣顆粒的條件不同，相同的條件下僅有Qβ衣殼蛋白時(shí)無法表達(dá)出病毒樣顆粒。A1蛋白在Qβ-VLPs的形成和穩(wěn)定中可能發(fā)揮著重要作用，本實(shí)驗(yàn)未做深入探討。

本研究使用3種不同的表達(dá)菌株，最終使用BL21(DE3)pLysS菌株制備出了具有球形結(jié)構(gòu)的Qβ-VLPs。該菌株帶有表達(dá)T7溶菌酶基因序列的pLysS質(zhì)粒，表達(dá)的T7溶菌酶可以降低目的基因的背景表達(dá)，但不干擾IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)[12]，攜帶有pLysS質(zhì)粒的菌株在原核表達(dá)中應(yīng)用廣泛[13，14]。降低背景蛋白表達(dá)能降低菌株的負(fù)擔(dān)[15]，Qβ衣殼蛋白可以自組裝形成正確空間結(jié)構(gòu)，背景蛋白降低可以減弱雜蛋白對(duì)Qβ衣殼蛋白形成空間結(jié)構(gòu)的影響，有利于合成正確的空間結(jié)構(gòu)。

Qβ-VLPs是由180個(gè)衣殼蛋白單體組成的20面體結(jié)構(gòu)，單體之間可以通過二硫鍵形成穩(wěn)定的5-6聚體，5-6聚體的存在可以初步驗(yàn)證空間結(jié)構(gòu)的建立[16]。本實(shí)驗(yàn)用SDS-PAGE驗(yàn)證3種菌株表達(dá)Qβ-VLPs的結(jié)果，只有BL21(DE3)pLysS菌株可以形成5-6聚體，筆者進(jìn)一步通過透射電鏡觀察3種菌株表達(dá)Qβ-VLPs的空間結(jié)構(gòu)，只有BL21(DE3)pLysS形成球形結(jié)構(gòu)，與5-6聚體的形成可以初步判定球形空間結(jié)構(gòu)形成的結(jié)論一致。

獲得Qβ-VLPs后，我們對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，IPTG在蛋白的表達(dá)過程中發(fā)揮著重要作用，可以使得生長(zhǎng)階段的菌株轉(zhuǎn)化成表達(dá)階段的菌株，而且誘導(dǎo)劑濃度可以顯著影響蛋白的產(chǎn)量，IPTG濃度過低會(huì)使得表達(dá)產(chǎn)量低，過高會(huì)打破菌株代謝平衡，產(chǎn)生毒性[17]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了0.2 mM和0.5 mM兩個(gè)IPTG的工作濃度，結(jié)果顯示，0.5 mM IPTG得到的Qβ-VLPs比0.2 mM IPTG得到的Qβ-VLPs產(chǎn)量高。

Qβ-VLPs具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，菌體的充分破碎，破碎過程對(duì)蛋白空間結(jié)構(gòu)不造成明顯影響，且破碎后的產(chǎn)物方便下一步的分離純化，是選擇病毒樣顆粒表達(dá)菌破碎方法的重要因素。本研究設(shè)計(jì)了3種不同的菌體裂解方式，超聲破碎、液氮反復(fù)凍融和溶菌酶裂解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反復(fù)凍融法得到的蛋白產(chǎn)量較低，因?yàn)樵诓僮鬟^程中會(huì)產(chǎn)生大量的黏性產(chǎn)物，離心和過濾較為困難，蛋白回收效率較低。溶菌酶法和超聲破碎對(duì)Qβ-VLPs的產(chǎn)量影響較小，超聲破碎操作簡(jiǎn)便，菌體破碎徹底，不會(huì)產(chǎn)生不易分離的黏性物質(zhì)，并且超聲破碎不會(huì)引入新的雜蛋白，不會(huì)增加后續(xù)純化過程的難度，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得數(shù)據(jù)傾向于使用超聲破碎法進(jìn)行菌體裂解。

菌體破碎得到蛋白上清液后，本實(shí)驗(yàn)先用20%和50%濃度的硫酸銨進(jìn)行初步純化，然后通過高速離心進(jìn)行純化，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)離子交換柱獲得Qβ-VLPs產(chǎn)量較低，損失較大。因此，本次實(shí)驗(yàn)過程中取消離子交換柱純化的步驟，直接通過分子篩分選即可以得到純度較高的Qβ-VLPs。

Qβ-VLPs在納米載體領(lǐng)域和疫苗領(lǐng)域都應(yīng)用廣泛，而且比其他的病毒樣顆粒穩(wěn)定[18]，使得有關(guān)Qβ-VLPs的研究也更為全面。Qβ-VLPs可以激發(fā)T細(xì)胞依賴和非T細(xì)胞依賴的抗體應(yīng)答，Qβ-VLPs內(nèi)的TLR(Toll-like receptor，Toll樣受體)配體可以很大程度的促進(jìn)Qβ-VLPs的免疫應(yīng)答，并且B細(xì)胞內(nèi)的TLR信號(hào)通路承擔(dān)此效應(yīng)，因此，Qβ-VLPs成為研究B細(xì)胞TLR信號(hào)的理想抗原[19]。在疫苗領(lǐng)域，IL-17與Qβ-VLPs交聯(lián)制備的疫苗在治療自身免疫性炎癥性疾病時(shí)表現(xiàn)較好，對(duì)疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體進(jìn)行分子水平的研究，發(fā)現(xiàn)自身產(chǎn)生的抗體與IL-17具有較高的親和力[20]。通過α-Gal與Qβ-VLPs交聯(lián)制備的疫苗可以對(duì)過敏反應(yīng)和利什曼蟲感染產(chǎn)生一定的治療效果[21-22]。Qβ-VLPs的形成和解聚過程研究也較為充分，對(duì)Qβ衣殼蛋白解聚和組裝過程進(jìn)行研究，使得對(duì)Qβ-VLPs的研究更為全面[18]，也使其具有更大的潛在研究?jī)r(jià)值，本次實(shí)驗(yàn)制備出更為安全的Qβ-VLPs，為Qβ-VLPs后續(xù)研究奠定一定基礎(chǔ)。

綜上所述，Qβ-VLPs在疫苗研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用，本研究通過不同表達(dá)菌株獲得具有正確空間結(jié)構(gòu)的Qβ-VLPs，通過改變IPTG濃度優(yōu)化其表達(dá)條件，設(shè)置3種菌體破碎方式，依據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果和操作過程綜合考慮選擇超聲破碎的方法，通過硫酸銨沉淀、高速離心和分子篩分選等蛋白純化方案，最終制備出產(chǎn)量和純度都較高的Qβ-VLPs，為Qβ-VLPs在骨質(zhì)疏松疫苗領(lǐng)域的研究和應(yīng)用奠定可靠基礎(chǔ)。