趙道全，武慧慧，陳軍平，李先明，謝國強(qiáng)，胡亞東，李治勛

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基于SCSA烏蘇里擬鲿精子保存液的使用效果＊

趙道全，武慧慧，陳軍平，李先明，謝國強(qiáng)，胡亞東，李治勛

（河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院，河南 鄭州 450044）

魚類精子質(zhì)量是影響人工繁殖的重要因素，雌雄性成熟不同步或需殺雄魚取精的魚類，為了保障其規(guī)?；敝常捎镁颖４嬉簩⒕訒捍嫫饋?，繁殖時(shí)隨用隨取，因此，精子保存液的保存效果又直接影響著人工繁殖。如何確定保存液中精子的質(zhì)量，可以用鏡檢宏觀判斷，但這樣并不精準(zhǔn)。SCSA通過量化判斷出保存液中精子的質(zhì)量，從而為繁殖提供保障。自行研制的hnscz擬鲿精子保存液經(jīng)SCSA分析測(cè)試，其實(shí)際應(yīng)用優(yōu)于購買的hanks精子保存液。測(cè)試結(jié)果為≤0.15，精子活力旺盛，使用效果明顯。

SCSA；精子保存液；DNA斷裂指數(shù)；精子活力

烏蘇里擬鲿（Pseudobagrus ussuriensis）隸屬于鲇形目鲿科魚類，生活于江河底層，以底棲動(dòng)物為食，如蜉蝣類、毛翅幼蟲等，幼魚以搖蚊幼蟲為食。

該魚分布在我國各大水系，但總體資源量有限，屬稀有物種。3 齡達(dá)性成熟，產(chǎn)卵期在5月中旬至7月末，自然產(chǎn)卵量很少。

人工繁殖需殺雄魚取精，規(guī)?；敝承杼崆坝帽４嬉罕４?zhèn)溆?，從而提高效率和效果?/p>

精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（SCSA）是檢測(cè)精子DNA完整性的一種方法，其原理是正常精子DNA呈雙鏈結(jié)構(gòu)，而受損的精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，DNA在酸的作用下變性成單鏈。利用吖啶橙（AO）與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)綠色熒光，而與單鏈DNA結(jié)合發(fā)紅色熒光的特性，AO染色后的精子懸液利用流式細(xì)胞儀分析可判斷精子質(zhì)量[1]。

1 材料和方法

試劑：吖啶橙（AO）染液、鹽酸、hanks精子保存液（商品購買）、hnscz精子保存液（自配優(yōu)選）。

樣本：取精子研磨[2]，分別取hnscz和hanks精子保存液各8 mL，顯微鏡觀察后稀釋精液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間段，提前按4 h、96 h、144 h稀釋好后分別用試管標(biāo)號(hào)放置于4 ℃冰箱冷藏保存待用[3-5]。

分別取hnscz和hanks保存的4 h、96 h、144 h精子各30 μL；+ 酸吸液80 μL（反應(yīng)30 s）；+ AO染色液100 μL（反應(yīng)3 min）；上機(jī)（Cyto FLEX流式細(xì)胞儀）檢測(cè)。

實(shí)際人工授精驗(yàn)證分別取不同保存時(shí)間的精子與人工催產(chǎn)后擠出的烏蘇里擬鲿卵授精[6]，把授精卵分別按標(biāo)號(hào)放入孵化框，在孵化槽中孵化5 h統(tǒng)計(jì)受精率[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 斷裂指數(shù)分析

在FSC/SSC圖上圈出精子細(xì)胞，設(shè)門至FL1（FITC）/FL3（ECD）散點(diǎn)圖上進(jìn)行分析。DNA完整性好的精子主要發(fā)綠色熒光（P2 門）；DNA完整性差的精子主要發(fā)紅色熒光（P4 門）。通過公式計(jì)算DNA斷裂指數(shù)來評(píng)價(jià)精子DNA質(zhì)量，=red/（red + green）.

從實(shí)驗(yàn)測(cè)試數(shù)據(jù)得出以下結(jié)果。

Hnscz：

1=6.37÷（39.03+6.37）=0.14.

2=11.28÷（40.65+11.28）=0.21.

3=9.48÷（23.23+9.48）=0.29.

Hanks：

1=9.44÷（32.10+9.44）=0.23.

2=8.29÷（17.18+8.29）=0.32.

3=18.85÷（38.54+18.85）=0.32.

從以上斷裂指數(shù)結(jié)果來看，我們配置的hnscz精子保存液保存的精子比購買的hanks精子保存液保存的精子的斷裂指數(shù)小，即hnscz1＜hanks1；hnscz2＜hanks2；hnscz3＜hanks3，這說明自己研制的精子保存液hnscz優(yōu)于商業(yè)購買的hanks精子保存液。

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析

兩種精子保存液實(shí)用效果對(duì)照如表1所示。

表1 兩種精子保存液實(shí)用效果對(duì)照

精子保存時(shí)間/h496144 hnscz受精率/（%）98.287.681.4 hanks受精率/（%）83.013.311.5

實(shí)際人工授精驗(yàn)證結(jié)果：hnscz保存的精子144 h受精率81.4%，保持較高水平，與流式細(xì)胞儀測(cè)試的DNA斷裂指數(shù)hnscz3=0.29，與較低水平結(jié)果相吻合；hanks保存的精子144 h受精率11.5%，已達(dá)到很低的水平，不能作為實(shí)際人工繁殖使用，與流式細(xì)胞儀測(cè)試的DNA斷裂指數(shù)hanks3=0.32較高水平的結(jié)果一致。

2.3 鏡檢觀察

用顯微鏡觀察[8-9]，hnscz保存液保存的精子6 d精子活力還旺盛，7 d活力開始減弱，9 d死亡；hanks保存液保存的精子1 d、2 d活力較強(qiáng)，4 d活力減弱，5 d死亡。

3 結(jié)論

SCSA判定精子質(zhì)量快速準(zhǔn)確，并能量化分析，是人工保存精子使用前檢測(cè)精子活力強(qiáng)弱的重要手段。

烏蘇里擬鲿精子保存液hnscz經(jīng)SCSA分析和實(shí)際應(yīng)用檢驗(yàn)，在4 ℃冰箱中可以人工保存一周時(shí)間并保持精子活力旺盛，是實(shí)現(xiàn)規(guī)?；敝车谋ＷC。

對(duì)于烏蘇里擬鲿人工保存的精子來說，根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]和測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析認(rèn)為，DNA斷裂指數(shù)≤0.15則精子活力旺盛，保存的精子可以作為人工授精的精子來源。DNA斷裂指數(shù)≥0.3則精子趨于衰竭，不再作為人工授精的精液來源。

［1］Apedaile AE，Garrett C，Liu DY，et al. Flow cytometry and microscopic acridine orange test：relationship with standard semen analysis［J］.Reprod Biomed Online，2004，8（04）：398-407.

［2］楊家云.瓦氏黃顙魚精巢發(fā)育及精子生物學(xué)研究［J］.西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，30（04）：719-724.

［3］陳松林.魚類精子和胚胎冷凍保存理論和技術(shù)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.

［4］陳松林，劉憲亭，魯大春，等.鰱、鯉、團(tuán)頭魴和草魚精液冷凍保存的研究［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào)，1992，38（04）：413-424.

［5］于海濤，張秀梅，陳超.魚類精液超低溫冷凍保存的研究展望［J］.海洋湖沼通報(bào)，2004（02）：66-72.

［6］王明華，蔡永祥，陳校輝，等.烏蘇里擬鲿人工繁育技術(shù)［J］.水產(chǎn)養(yǎng)殖，2010，31（04）：23-24.

［7］高征，崔杰，徐廣紅，等.烏蘇里擬鲿人工繁殖方法［M］.長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2010.

［8］羅相忠，鄒桂偉，潘光碧.大口鲇精子生理特性的研究［J］.淡水漁業(yè)，2002，32（02）：51-53.

［9］魯大春，傅朝君，劉憲亭，等.我國主要淡水養(yǎng)殖魚類精液的生物學(xué)特性［J］.淡水漁業(yè)，1989（02）：34-37.

趙道全（1964—），男，教授級(jí)高級(jí)工程師，從事魚類遺傳育種及工廠化養(yǎng)殖技術(shù)研究。

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：172102110097）

2095－6835（2019）02－0008－02

Q492

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.02.008

〔編輯：張思楠〕