(大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116034)

乳清蛋白膜具有黏性和伸縮性,在較低的濕度條件下具有優(yōu)良的氧氣和油脂阻隔性。然而由于含有較多的親水性氨基酸,乳清蛋白膜的機(jī)械強(qiáng)度和水蒸氣阻隔性能較差,因此利用可再生的纖維素和殼聚糖等添加入蛋白膜基質(zhì)進(jìn)行共混改性,對(duì)乳清蛋白膜的性能進(jìn)行改良[1-2]。Yoo等[3]研究纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉分別與乳清蛋白制備復(fù)合膜,其表現(xiàn)出更低的透光率,更高的熱穩(wěn)定性,且具有與純的蛋白膜相似的阻水特性。

應(yīng)用酶法改性,也是改善蛋白質(zhì)成膜性質(zhì)的一種有效途徑。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG)可以催化發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng),促進(jìn)蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),從而可以改善蛋白膜的性能。韓翠萍等[7]將TG酶應(yīng)用于制備乳清蛋白膜,發(fā)現(xiàn)TG酶顯著增強(qiáng)了乳清蛋白膜的機(jī)械性能。

目前相關(guān)研究中關(guān)于纖維素對(duì)乳清蛋白膜的共混改性修飾和TG酶對(duì)乳清蛋白膜的改性研究較多,而利用多糖和TG酶共存條件對(duì)乳清蛋白膜性能修飾作用的研究較少?；谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn),NCC和TG酶在共存條件對(duì)乳清蛋白膜的性能具有修飾作用。本文側(cè)重研究TG酶的添加量對(duì)WPC-NCC復(fù)合膜的機(jī)械性能和屏障性能的影響作用,并探究TG酶對(duì)WPC-NCC復(fù)合膜微觀結(jié)構(gòu)的影響,為TG酶交聯(lián)WPC-NCC復(fù)合膜的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清濃縮蛋白WPC-80 德國(guó)米萊乳品公司;納米微晶纖維素水凝膠 納米微晶纖維素,干物質(zhì)含量為2% 上海開(kāi)翊新材料有限公司;轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 酶活為100 U/g蛋白江蘇一鳴生物制品有限公司;甘油 天津市恒興化學(xué)試劑公司;其他試劑 均為分析純。

IKA RT5磁力攪拌器 德國(guó)IKA有限公司;恒溫恒濕箱(KBF720) 德國(guó)Binder有限公司;質(zhì)構(gòu)儀(TA-XT plus) 英國(guó)Stable Micro System公司;傅里葉紅外光譜儀(Spectrum 10) 美國(guó)PE公司;場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(JSM-7800F) 日本電子株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合膜制備 將乳清濃縮蛋白粉末緩慢加入一定量的納米微晶纖維素水凝膠中,緩慢磁力攪拌2 h,避免出現(xiàn)氣泡,使其充分溶解均勻。隨后定容,使混合溶液中的蛋白終濃度為10%,NCC的干物質(zhì)含量為蛋白質(zhì)量的10%。分別向混合溶液中添加3、6、9、12 U/g蛋白的TG酶液,于50 ℃恒溫水浴反應(yīng)2 h。然后在80 ℃水浴滅酶10 min,迅速冷卻至室溫。最后加入45%的甘油(以蛋白質(zhì)量為基準(zhǔn))作為增塑劑,緩慢攪拌1 h,制得均勻的混合膜液。以未加TG酶處理的復(fù)合膜液為對(duì)照。

將成膜液倒入平皿中(90 mm×90 mm),緩慢晃動(dòng)平皿,使液面水平,置于恒溫恒濕箱中于35 ℃,RH 40%條件下烘干,揭膜后于25 ℃、RH 50%條件回軟24 h,備用。

1.2.2 厚度測(cè)定 采用均值法[8]。使用數(shù)顯外徑千分尺測(cè)定膜的厚度,在制備好的膜上任意選擇5個(gè)點(diǎn),測(cè)量厚度,取其平均值為膜的厚度。所測(cè)得膜的厚度作為機(jī)械性能和水蒸氣透過(guò)率的計(jì)算依據(jù)。

1.2.3 機(jī)械性能測(cè)定 采用質(zhì)構(gòu)儀法[9]。根據(jù)ASTM D882-02方法,使用A/TG探頭測(cè)定復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率。將膜裁剪為1 cm×4 cm的長(zhǎng)方形膜片,初始夾距設(shè)置為20 mm,拉伸速度設(shè)置為10 mm/s,有效拉伸距離為20 mm,記錄下膜樣品斷裂時(shí)的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率。樣品斷裂以在中間處斷裂為準(zhǔn),每組樣品重復(fù)測(cè)定9次。

1.2.4 透光率測(cè)定 采用分光光度計(jì)法。膜的透光率使用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定。根據(jù)Soazo等[7]方法,將膜裁剪成1 cm×4 cm的長(zhǎng)條膜片,置于比色皿內(nèi)側(cè),在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定膜的透光值,以空皿作為對(duì)照。

探索成立了“少數(shù)民族法律維權(quán)中心”，依托律師事務(wù)所的人才資源優(yōu)勢(shì)，成立了“昆明市少數(shù)民族法律維權(quán)中心”，篩選和儲(chǔ)備了維吾爾族、藏族、蒙古族、壯族等各族律師170多人，承擔(dān)處理少數(shù)民族投訴案件，開(kāi)通了少數(shù)民族綠色維權(quán)通道，確保少數(shù)民族流動(dòng)人口能獲得及時(shí)、高效、優(yōu)質(zhì)的法律服務(wù)。

1.2.5 水蒸氣透過(guò)率測(cè)定 采用擬杯子法[10]。將膜樣品置于恒溫恒濕箱25 ℃、RH 50%條件下24 h,達(dá)到平衡。將3.0 g無(wú)水氯化鈣添加至稱量皿中(直徑為2.6 cm,深度為3.0 cm),用各種膜樣品封蓋。將稱量皿放置于恒溫恒濕箱(25 ℃、RH 50%)中,每隔1 h稱量并記錄下封膜后稱量皿的質(zhì)量,持續(xù)稱量9 h。水蒸氣透過(guò)率值的計(jì)算,參考González等的方法[11],水蒸汽傳輸速率以通過(guò)膜進(jìn)入稱量皿的水蒸汽質(zhì)量相對(duì)于時(shí)間的變化繪圖曲線的斜率表示。

WVT=F/A

式(1)

式中,WVT-水蒸汽傳輸速率;F-線性圖斜率;A-暴露于蒸汽傳輸?shù)拿娣e,m2。

式(2)

式中,WVP-水蒸汽透過(guò)率,gmPa-1s-1m-2;S-在25 ℃時(shí)的飽和壓力,Pa;(RH1-RH2)-杯內(nèi)外部濕度差;e-膜的厚度,m。

1.2.6 紅外光譜 將不同TG酶添加量的WPC-NCC復(fù)合膜分別與一定量KBr用研缽充分研磨成均勻粉末,壓制成薄片。傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行全波段掃描(4000～400 cm-1),掃描次數(shù)為4次,分辨率4 cm-1,平行4次。用Omnic 8.2軟件在譜帶范圍內(nèi)(酰胺I帶1700～1600 cm-1)進(jìn)行基線校正,并經(jīng)去卷積處理,在二階導(dǎo)數(shù)譜圖基礎(chǔ)上用高斯(Gaussian)曲線擬合,估算出子峰的個(gè)數(shù)和位置,調(diào)整各子峰的半峰寬。確定各子峰與各個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的對(duì)應(yīng)關(guān)系后,根據(jù)峰面積計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)組分的相對(duì)百分含量[12]。

1.2.7 掃描電鏡 采用掃描電鏡(SEM)觀察。使用掃描電子顯微鏡掃描成膜的表面結(jié)構(gòu)。樣品剪成固定的形狀粘在金箔條上,在真空的條件下對(duì)樣品進(jìn)行處理,加速電壓為25 kV,10000倍的放大倍數(shù)下觀察膜表面的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,除去失敗膜的結(jié)果,試驗(yàn)結(jié)果主要采用軟件IMB SPSS Statistics 20中Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。用不同字母表示復(fù)合膜性能的差異顯著(P<0.05),利用軟件Origin 8.5繪圖報(bào)告結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜的機(jī)械性能分析

抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率等機(jī)械性能是探究生物材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)重要的指標(biāo)。包裝材料應(yīng)具有一定強(qiáng)度、韌性和延展性。如圖1所示,不同TG酶添加量對(duì)WPC-NCC復(fù)合膜抗拉強(qiáng)度的影響?？梢钥闯?復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度隨著TG酶添加量的增加而先增大后減小。與未添加TG酶的復(fù)合膜相比,當(dāng)TG酶添加量為9 U/g蛋白,抗拉強(qiáng)度由1.3 MPa增長(zhǎng)至2.38 MPa,達(dá)到最大值。這是由于TG酶的加入,促使乳清蛋白發(fā)生共價(jià)交聯(lián),對(duì)復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度起到了一定的增強(qiáng)效果。張春紅等[13]在研究TG酶改性對(duì)花生蛋白膜性能的影響中,發(fā)現(xiàn)了相似結(jié)果,TG酶的交聯(lián)作用,使蛋白膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率都得到了較大程度的提高。

TG酶的添加對(duì)復(fù)合膜的斷裂伸長(zhǎng)率具有增強(qiáng)效果。如圖1所示,隨著TG酶添加量的增加,復(fù)合膜的斷裂伸長(zhǎng)率顯著增大。與未添加TG酶的WPC-NCC復(fù)合膜相比,當(dāng)TG酶的添加量達(dá)到12 U/g蛋白,復(fù)合膜的斷裂伸長(zhǎng)率增長(zhǎng)了約30%。這主要由于TG酶的交聯(lián)作用,在分子內(nèi)和分子間形成了酰胺鍵,分子間作用力增強(qiáng)[14],從而在一定程度上提高了復(fù)合膜的斷裂伸長(zhǎng)率。這一結(jié)果與Wang等[15]研究不同添加量TG酶對(duì)明膠-碳酸鈣復(fù)合膜的影響的結(jié)果相一致,研究發(fā)現(xiàn)不同添加量的TG酶對(duì)復(fù)合膜斷裂伸長(zhǎng)率的增長(zhǎng)具有顯著作用。

圖1 TG酶對(duì)WPC-NCC復(fù)合膜機(jī)械性能的影響Fig.1 Effect of TGase on mechanicalproperties of WPC-NCC composite film注:不同小寫字母代表抗拉強(qiáng)度差異顯著(P<0.05);不同大寫字母代表斷裂伸長(zhǎng)率差異顯著(P<0.05)。

2.2 膜的屏障性能分析

包裝材料的透光性,能夠直觀地反映TG酶對(duì)乳清蛋白基質(zhì)膜表觀結(jié)構(gòu)的影響。圖2為不同TG酶添加量對(duì)WPC-NCC復(fù)合膜透光率的影響?？梢钥闯?隨著TG酶添加量的增加,復(fù)合膜的透光率在一定程度上有所下降,但差異不顯著。復(fù)合膜的外觀沒(méi)有太大的變化,呈現(xiàn)光滑透明的狀態(tài),復(fù)合膜在600 nm處的透光率保持在約為50%～60%。這一結(jié)果與姜燕[16]等利用TG酶對(duì)食物蛋白質(zhì)成膜性能的影響相一致,姜燕等中指出TG酶可以引起乳清蛋白的聚集和交聯(lián),成膜溶液的濁度增加,從而使成膜后透光率下降。

水蒸氣透過(guò)率(WVP)能夠代表包裝材料在包裝食品與外界環(huán)境之間,阻礙水分子的遷移能力,這一特性主要由包裝材料內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)所決定。圖2為不同TG酶添加量對(duì)WPC-NCC復(fù)合膜的水蒸氣透過(guò)率的影響。與未經(jīng)TG酶處理的WPC-NCC復(fù)合膜相比,當(dāng)TG酶添加量超過(guò)9 U/g蛋白,復(fù)合膜的水蒸氣透過(guò)率下降。這主要由于在TG酶的誘導(dǎo)作用下,可以在賴氨酸和谷氨酰胺之間形成共價(jià)鍵,從而形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[17],因此可以降低WPC-NCC復(fù)合膜的水蒸氣透過(guò)率。而Oh等[18]研究表明TG酶對(duì)酪蛋白膜、乳清蛋白膜、玉米蛋白-酪蛋白和玉米蛋白-乳清蛋白膜的水蒸氣透過(guò)率具有不同程度的影響,這可能由于制備方法、蛋白種類不同、以及交聯(lián)程度等因素共同調(diào)控著包裝材料的水蒸氣屏障性。

圖2 TG酶對(duì)WPC-NCC復(fù)合膜屏障性能的影響Fig.2 Effect of TGase on barrierproperties of WPC-NCC composite film注:不同小寫字母代表透光率差異顯著(P<0.05);不同大寫字母代表水蒸氣透過(guò)率差異顯著(P<0.05)。

2.3 紅外光譜分析

紅外光譜能夠表明分子中官能團(tuán)的振動(dòng)模式,并通過(guò)波數(shù)的變化顯示分子間的相互作用。圖3顯示為經(jīng)過(guò)不同TG酶添加量處理的WPC-NCC復(fù)合膜樣品的FTIR譜圖(4000～400 cm-1)。3600～3300 cm-1范圍為N-H伸縮振動(dòng)以及O-H伸縮振動(dòng)。文獻(xiàn)表明,當(dāng)形成分子內(nèi)或分子間氫鍵時(shí),O-H的吸收峰向低波數(shù)移動(dòng),且與N-H的振動(dòng)吸收峰重疊而峰形變寬[19-20]。由圖5可見(jiàn),隨著TG酶添加量的增加,復(fù)合膜樣品于3500 cm-1附近的吸收峰分別為:3414.65(0 U/g蛋白)、3401.93(3 U/g蛋白)、3386.86(6 U/g蛋白)、3386(9 U/g蛋白)、3370.71 cm-1(12 U/g蛋白)。表明經(jīng)過(guò)TG酶的處理,復(fù)合膜可能產(chǎn)生較強(qiáng)的分子內(nèi)或分子間氫鍵連接。

另外,波數(shù)1700～1600 cm-1范圍為酰胺I區(qū)(C=O伸縮振動(dòng)),這一區(qū)域主要與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)[21]。對(duì)酰胺Ⅰ帶進(jìn)行去卷積和二階導(dǎo)數(shù)技術(shù)處理后,疊加峰分解為9～13個(gè)子峰的高斯曲線擬合。表1是分別經(jīng)過(guò)不同添加量TG酶(0～12 U/g蛋白)處理的WPC-NCC復(fù)合膜樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化,隨TG酶添加量的增加,α-螺旋(1650～1660 cm-1)在二級(jí)結(jié)構(gòu)中的比例顯著增大(P<0.05),而β-折疊(1610～1640 cm-1,1670～1680 cm-1)和無(wú)規(guī)則卷曲(1640～1650 cm-1)的含量顯著下降(P<0.05)。在不同加酶量處理的WPC-NCC復(fù)合膜中,其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以β-轉(zhuǎn)角(166～1670 cm-1,1680～1700 cm-1)和β-折疊為主,這兩者主要與弱相互作用有關(guān),如氫鍵、范德華力和靜電相互作用等,說(shuō)明弱相互作用在維持成膜結(jié)構(gòu)具有很大的作用。而α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲(random coil)含量相對(duì)較少。α-螺旋主要與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān),而無(wú)規(guī)卷曲的含量影響著蛋白結(jié)構(gòu)的有序性。TG酶的交聯(lián)作用,使得α-螺旋含量升高,無(wú)規(guī)卷曲的含量下降,表明乳清蛋白的結(jié)構(gòu)向穩(wěn)定性和有序性變化,增強(qiáng)了成膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。這一結(jié)果與圖1中WPC-NCC復(fù)合膜的機(jī)械性能隨加酶量的增加而顯著提升密切相關(guān)。Wu等[12]研究TG酶對(duì)膠原膜的機(jī)械性能和熱穩(wěn)定性能,得出了相似結(jié)果,指出TG酶的交聯(lián)處理使得蛋白質(zhì)中的弱相互作用增強(qiáng),蛋白質(zhì)的無(wú)序性降低,從而使蛋白膜的熱穩(wěn)定性和機(jī)械性能顯著提高。

表1 不同TG酶添加量的WPC-NCC復(fù)合膜的二級(jí)結(jié)構(gòu)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Table 1 Secondary structure of WPC-NCC composite films with different concentrations of TGase treated(Mean±SD)

圖3 不同TG酶添加量的WPC-NCC復(fù)合膜的紅外光譜Fig.3 FITR spectra of WPC-NCC composite filmswith different concentrations of TGase treated

注:同列數(shù)據(jù)右上角標(biāo)示不同小寫字母表示二級(jí)結(jié)構(gòu)含量差異顯著性(P<0.05)。

2.4 掃描電鏡分析

膜的各種性能,很大程度上依賴于成膜材料的分子排列規(guī)整性,分子間作用力強(qiáng)弱以及大分子在成膜溶液中的溶解性等[15],因此復(fù)合膜微觀結(jié)構(gòu)與成膜性能密切相關(guān)。不同TG酶添加量的WPC-NCC復(fù)合膜在掃描電鏡10000倍下觀察的結(jié)果如圖4所示。經(jīng)TG酶處理的WPC-NCC復(fù)合膜與未經(jīng)TG酶處理的復(fù)合膜樣品的表面形貌沒(méi)有顯著差別。在10000倍掃描電鏡觀察下,未經(jīng)TG酶處理的WPC-NCC復(fù)合膜呈現(xiàn)凹凸不平,粗糙的結(jié)構(gòu),且具有大量不規(guī)則孔洞,因此WPC-NCC復(fù)合膜仍具有較高的水蒸氣透過(guò)率。而隨著TG酶添加量的增加,復(fù)合膜表面的孔洞數(shù)量顯著減少且直徑減小,這一結(jié)果與圖2中水蒸氣透過(guò)率隨著加酶量的增加而降低密切相關(guān)。當(dāng)TG酶量超過(guò)9 U/g蛋白,復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出更加致密的結(jié)構(gòu),主要由于TG酶的交聯(lián)作用,使乳清蛋白生成大分子聚合物,具有一定的空間結(jié)構(gòu),因此在WPC-NCC復(fù)合膜表面呈現(xiàn)不均勻,不平整的結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果與Wang等[15]在TG酶誘導(dǎo)明膠-碳酸鈣交聯(lián)膜相似,其研究中指出TG酶的交聯(lián)作用,使得復(fù)合膜的表面微觀結(jié)構(gòu)更加致密緊湊,同時(shí)顯著增加了不均勻的程度。

圖4 不同TG酶添加量的WPC-NCC復(fù)合膜的電鏡掃描圖(×10000倍)Fig.4 SEM micrographs of WPC-NCC composite filmswith different concentrations of TGase treated(×10000)

3 結(jié)論

TG酶對(duì)WPC-NCC復(fù)合膜的的機(jī)械性能和屏障性能影響顯著。當(dāng)TG酶量達(dá)到12 U/g蛋白時(shí),WPC-NCC復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度由1.78 MPa增長(zhǎng)至2.25 MPa,斷裂伸長(zhǎng)率由56.53%增長(zhǎng)至86.75%,水蒸氣透過(guò)率由4.97×10-12gmPa-1s-1m-2降低至4.40×10-12gmPa-1s-1m-2,蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)向穩(wěn)定有序的方向轉(zhuǎn)化,復(fù)合膜的表觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。TG酶交聯(lián)WPC-NCC復(fù)合膜的研究,將拓展乳清蛋白基復(fù)合膜的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。