,*

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)村發(fā)展學(xué)院,河北保定071000)

黑色食品(Mat Black,MB)主要指天然黑色或顏色較深,營(yíng)養(yǎng)較豐富平衡并具有一定調(diào)節(jié)人體生理功能的一類食品[1],MB的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及功能性均高于同類非MB[2],主要分為兩類,一類為天然MB,另一類是經(jīng)加工褐變而成的MB[3],如:黑醬油、豆豉、黑啤酒、黑蒜等。大蒜、豆豉能通過(guò)加工能成為MB,其成色機(jī)理主要是:加工過(guò)程的酶促褐變、美拉德反應(yīng),酚類物質(zhì)的自生縮合、微生物產(chǎn)生黑色素及焦糖化反應(yīng)形成黑色或褐色的物質(zhì),促使原來(lái)的食品褐變成MB[4-9]。

柿子具有多種活性成分,營(yíng)養(yǎng)豐富[10-12]。我國(guó)是柿子的主要生產(chǎn)國(guó)家,占世界總產(chǎn)量的70%～80%[13]。國(guó)內(nèi)外對(duì)柿子的研究及加工除了鮮食,人們主要把它加工成柿子飲料、柿餅、罐頭、面包、醬及其它柿子產(chǎn)品等。由于柿子加工的局限性,致使柿子總加工量不到10%,貿(mào)易額僅占全球總額3%左右[14-15]。目前,在MB發(fā)酵加工中利用的可食安全真菌有黑曲霉Asp.niger、米曲霉Asp.oryzae、毛霉M. sp、根霉R. sp.等,Asp.niger在發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生纖維素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖、氧化酶、果膠酶、沒(méi)食子酸等,Asp.oryzae發(fā)酵過(guò)程能產(chǎn)生典型揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等,M. sp能產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶等,R. sp.能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、果膠酶等[16-17]。

為增加柿子的加工途徑,提高柿子的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本論文根據(jù)黑蒜及黑醬油的成色機(jī)理,以柿子為顏料,利用微生物能產(chǎn)生多種酶的特點(diǎn),通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)來(lái)研究磨盤柿發(fā)酵黑柿的最佳褐變工藝條件,本文比較4種真菌對(duì)發(fā)酵柿子褐變程度的影響,通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化Asp.niger發(fā)酵柿子褐變條件,得到影響褐變的顯著因素和適宜條件,可為柿子黑色產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磨盤柿 河北保定茂源果品股份有限公司提供蛋白質(zhì)含量0.05%、碳水化合物含量17%、水分83.4%、膳食纖維1.4%、灰分2.7%;黑曲霉(Aspergillusniger)、毛霉(Mucorsp.)、根霉(Rhizopussp.)、米曲霉(Aspergillusoryzae) 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供;NaOH(AR) 天津益仁達(dá)化工有限公司;純凈水 蘭州信盈飲品有限公司;PDA培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)室自制。

DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海恒一科學(xué)儀器有限公司;BT200微電腦電陶爐 中山奔騰電器有限公司;L550臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司;752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公公司;YX280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司;XH-C快速混合器 江蘇省金壇市醫(yī)療器械廠;EB-28BI雙目光學(xué)生物顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;LBJ-620 榨汁攪拌機(jī)東菀市樂(lè)邦電子有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵黑柿子工藝流程 原料篩選→清洗→切塊→打漿→分裝→滅菌→接種→發(fā)酵(指標(biāo)測(cè)定)→黑柿

1.2.2 操作要點(diǎn) 原料篩選:選擇表面光滑、無(wú)斑、無(wú)損傷的柿子作為原料。

原料處理:將挑選的柿子洗凈切成約1 cm×1 cm×1 cm大小的塊狀,打漿(兩層紗布過(guò)濾),每個(gè)玻璃容器中分裝500.00 g,用紗布封住口后,0.1～0.15 MPa高壓滅菌30 min,取出置于無(wú)菌超凈臺(tái)上冷卻到室溫待用。

菌種活化[18]:將4種真菌以相同的手法接種到新制備的PDA培養(yǎng)基上,于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)待產(chǎn)孢子時(shí),取出在4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

菌懸液的制備[19]:將活化好的菌種管用5～10 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液反復(fù)吹洗斜面,將孢子及菌絲轉(zhuǎn)至無(wú)菌離心管,4000 r/min離心15 min棄其上清液,取一定質(zhì)量的沉淀用0.9%氯化鈉溶液稀釋成1×10-4g/mL的菌懸液。

接種:無(wú)菌條件下,取一定量1×10-4g/mL的菌懸液用0.9%氯化鈉溶液定容至10 mL加入經(jīng)處理后的柿子漿中,攪勻后封口,轉(zhuǎn)入一定溫度的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵一定時(shí)間,3 d翻攪一次,并監(jiān)測(cè)水分使其含量保持在70%～80%范圍內(nèi)。以加入10 mL0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液的柿子漿發(fā)酵瓶作對(duì)照,以0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為空白。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 不同真菌對(duì)褐變度的影響 無(wú)菌條件下,分別取Asp.niger、M. sp.、Asp.oryzae、R. sp. 10 mL的菌懸液接入分裝處理好的柿子漿中,攪拌均勻,封口在32 ℃恒溫發(fā)酵。經(jīng)肉眼觀察發(fā)酵柿子漿褐變程度較大時(shí),分別測(cè)定4種真菌對(duì)應(yīng)的發(fā)酵物褐變度值,選擇褐變度值最大實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的微生物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),記錄柿子發(fā)生明顯褐變的時(shí)間,為研究發(fā)酵時(shí)間、溫度單因素對(duì)柿子褐變的影響做參考。

1.2.3.2 發(fā)酵溫度對(duì)褐變度的影響 無(wú)菌條件下,分別向5組處理過(guò)的柿子漿瓶中,接入Asp.niger的菌懸液10 mL,攪拌均勻,封口,分別放入22、27、32、37、42 ℃恒環(huán)境中恒溫發(fā)酵36 d,測(cè)定褐變度值,篩選出最適發(fā)酵溫度。

1.2.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)褐變度的影響 在無(wú)菌條件下,向分裝處理好的柿子漿瓶接入Asp.niger的菌懸液放入32 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、84、96 d,將篩選得到的微生物菌懸液接入處理過(guò)的柿子漿瓶中,最有利發(fā)酵褐變的溫度條件下恒溫發(fā)酵,定時(shí)翻拌,監(jiān)測(cè)水分含量,每12 d測(cè)一個(gè)樣品的褐變度值,通過(guò)比較篩選出最佳發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)。

1.2.3.4 加入菌懸液的量對(duì)褐變度的影響 分別取Asp.niger的菌懸液2、4、6、8、10 mL,用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至10 mL的接入分裝處理好的柿子漿瓶,充分拌均,定時(shí)翻拌,監(jiān)測(cè)水分含量。在溫度為32 ℃、發(fā)酵72 d,后測(cè)定其褐變度值。找出發(fā)酵最適Asp.niger接種菌懸液的量。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 參照趙自通等[20]人的方法,略作修改:在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Design-Expert 11.0.4軟件中的Box-Behnken進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì),以Asp.niger的菌懸液的量(6、8、10 mL)、發(fā)酵溫度(27、32、37 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(60、72、84 d)三個(gè)因素為自變量,方案如表1所示。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)結(jié)果分析,確定因素間的交互作用對(duì)柿子褐變的影響,優(yōu)化柿子褐變條件。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 褐變度的測(cè)定 根據(jù)果蔬褐變度的測(cè)定方法[8,20-21],略作修改:取10.0000 g具有代表性發(fā)酵物充分研磨后用15 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液洗入燒杯中,沸水浴5 min,冷卻至室溫,轉(zhuǎn)入離心機(jī)以1000 r/min離心10 min,取其上清液在λ420 nm下的測(cè)其吸光值,以A420×10值表示褐變度,褐變度=褐變度實(shí)驗(yàn)組-褐變度對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)處理組重復(fù)三次,都設(shè)有空白對(duì)照,數(shù)據(jù)以平均值表示,采用Origin Pro 2018c軟件,Design-Expert 11.0.4軟件,Excel 2016軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種真菌對(duì)柿子褐變度的影響

由圖1可知,4種真菌對(duì)柿子褐變的影響為:Asp.niger>R. sp.>Asp.oryzae>M. sp.。Asp.niger和R. sp.對(duì)柿子褐變影響較大的原因有三種:一是Asp.niger、R. sp.自身可以產(chǎn)生黑色孢子,可以使柿子漿顏色變深[22];二是Asp.niger、R. sp.產(chǎn)生的酶與柿子漿中的小分子物質(zhì)發(fā)生褐變反應(yīng);三是Asp.niger和R. sp.自身可以分泌黑色素[23]。從實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡慕嵌瓤紤],選擇Asp.niger作為黑柿子發(fā)酵真菌。Asp.niger、R. sp.能夠分泌糖化酶、果膠酶,可以降解柿子果漿中的果膠、淀粉等大分子物質(zhì)成為小分子糖類,有利于美拉德反應(yīng),所以選擇Asp.niger用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 4種真菌對(duì)柿子褐變度的影響Fig.1 Effects of four fungi on thebrowning degree of persimmon

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)柿子褐變度的影響

由圖2可以看出,接種Asp.niger對(duì)柿子漿在溫度為32 ℃時(shí)恒溫發(fā)酵,柿子漿褐變效果最好,可能是因?yàn)?2 ℃是Asp.niger生長(zhǎng)最適宜的溫度,發(fā)酵溫度在22～32 ℃區(qū)間,柿子的褐變度隨溫度的升高而增大,可能是因?yàn)?2～32 ℃區(qū)間,溫度是影響Asp.niger生長(zhǎng)促進(jìn)褐變的主要因素;在37～42 ℃時(shí)沒(méi)有22～32 ℃褐變效果佳,但褐變度變化波動(dòng)不太大,可能是因?yàn)闇囟容^高對(duì)Asp.niger生長(zhǎng)代謝有一定抑制作用,所以32 ℃是發(fā)酵的最佳溫度,與隋雨菲[24]等人研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉的生長(zhǎng)溫度接近。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)柿子褐變度的影響Fig.2 Effects of fermentation temperatureon browning degree of persimmon

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)柿子褐變度的影響

由圖3可知:發(fā)酵天數(shù)小于72 d時(shí),接種Asp.niger的柿子漿的褐變度逐漸隨發(fā)酵天數(shù)的延長(zhǎng)而增加。在72 d后褐變基本保持不變,發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)為24～36 d與12～24 d相比褐變度變化較大,可能是因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)長(zhǎng)為24～36 d時(shí),柿子漿中的環(huán)境最適合Asp.niger生長(zhǎng)繁殖,使Asp.niger量達(dá)到鼎盛時(shí)期;在72 d以后褐變度幾乎保持不變,可能是因?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期或衰亡期,發(fā)酵時(shí)間不是Asp.niger促進(jìn)柿子漿褐變的主要原因。故發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)為72 d是柿子褐變最好的時(shí)長(zhǎng)。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)柿子褐變度的影響Fig.3 Effects of fermentation timeon browning degree of persimmon

2.4 加入菌懸液量對(duì)柿子褐變的影響

由圖4可知,發(fā)酵柿子漿接種Asp.niger菌懸液的量小于6 mL時(shí),柿子的褐變度隨菌懸液量的增大而增大,Asp.niger菌懸液的量在2～6 mL范圍內(nèi),柿子的褐變度隨菌懸液量的改變變化較明顯,當(dāng)菌懸液的量大于8 mL時(shí),菌懸液的量增加對(duì)柿子褐變度的影響不明顯,可能是因?yàn)槲⑸锪窟_(dá)到飽和,這時(shí)微生物的量不是影響褐變度的主要因素,說(shuō)明Asp.niger菌懸液的量達(dá)到一定限度時(shí),對(duì)發(fā)酵柿子漿褐變影響不明顯。

圖4 初始菌懸液量對(duì)柿子褐變度的影響Fig.4 Effects of suspension liquid volumes offungi on browning degree of persimmon

2.5 發(fā)酵柿子褐變條件響應(yīng)面優(yōu)化

2.5.1 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,利用Design-Expert 11.0.4軟件進(jìn)行Box-Behnken優(yōu)化,以以Asp.niger的菌懸液的量(6、8、10 mL)、發(fā)酵溫度(27、32、37 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(60、72、84 d)三個(gè)因素為自變量,褐變度為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

表3 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variance of results of Box-Behnken response surface methodology

注:**代表極顯著,P<0.01;*代表顯著,P<0.05。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results ofBox-Behnken response surface methodology

2.5.2 模型的建立與顯著性分析 以柿子的褐變度為響應(yīng)面值,根據(jù)表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果,用Design-Expert 11.0.4軟件進(jìn)行多因素回歸擬合分析,具體結(jié)果如表3。經(jīng)回歸擬合分析后,實(shí)驗(yàn)因子Asp.niger菌懸液的量(A)、發(fā)酵時(shí)間(B)、發(fā)酵溫度(C)對(duì)褐變度(Y)的影響可用以下回歸方程表示:

Y=5.56-0.53A+0.23B+0.128C+0.39AB-0.057AC-0.26BC-1.11A2-0.78B2-0.50C2

由表3可知,其F=38.09,P<0.0001,說(shuō)明本模型擬合程度達(dá)到極顯著水平;失擬項(xiàng)不顯著,其失擬檢驗(yàn)的F值為0.49,存在71.07%的失擬,失擬項(xiàng)在α=0.05水平上不顯著(P=0.7107>0.05),模型的R2=0.98,說(shuō)明該模型的可信度較高。在所選各因素的水平范圍內(nèi),按照對(duì)結(jié)果的影響排序,Asp.niger菌懸液的量(A)>發(fā)酵溫度(C)>發(fā)酵時(shí)間(B)。

從方差分析結(jié)果可得,方程的模型A、C、AB、A2、B2、C2對(duì)柿子褐變度的影響極顯著,B、BC對(duì)柿子褐變度的影響顯著,AC對(duì)柿子褐變度的影響不顯著。

2.5.3 響應(yīng)面交互作用分析 二元擬合模型的響應(yīng)面分析結(jié)果如圖5所示,表示用于響應(yīng)面Asp.niger菌懸液的量(A)、發(fā)酵時(shí)間(B)、發(fā)酵溫度(C)3個(gè)因子中,當(dāng)某個(gè)因子為固定水平時(shí),另外兩個(gè)因子對(duì)褐變度的協(xié)同作用關(guān)系,等高線的形狀可以直觀反應(yīng)兩因子的交互作用強(qiáng)弱和顯著程度。由圖5可知,菌懸液的量與發(fā)酵時(shí)間的等高線中心區(qū)域呈橢圓形、相對(duì)較密集并且曲面較陡峭,說(shuō)明二者之間交互作用明顯;菌懸液的量與發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度的等高線圖中心區(qū)域也構(gòu)成橢圓,但菌懸液的量與發(fā)酵溫度構(gòu)成的曲面相對(duì)較平緩、沒(méi)構(gòu)成橢圓,說(shuō)明菌懸液的量與發(fā)酵溫度的交互作用相對(duì)于菌懸液的量與發(fā)酵時(shí)間要弱;發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度構(gòu)成的曲面相對(duì)于菌懸液的量與發(fā)酵溫度要陡峭,說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度的交互作用相對(duì)于菌懸液的量與發(fā)酵溫度要明顯;此外,菌懸液的量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度三因子與響應(yīng)面值褐變度均成拋物線關(guān)系,且響應(yīng)面均為凸面開(kāi)口向下說(shuō)明在試驗(yàn)點(diǎn)的連續(xù)區(qū)域內(nèi)存在最大值。通過(guò)二元擬合求解,預(yù)測(cè)其最佳褐變工藝條件為Asp.niger菌懸液的量7.51 mL、發(fā)酵溫度33.49 ℃、發(fā)酵時(shí)間72.53 d,在此條件下褐變度的理論預(yù)測(cè)值為5.668。

圖5 各因素交互作用對(duì)柿子褐變度的影響Fig.5 Effects of interaction of various factorson browning degree of persimmon

2.5.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 驗(yàn)證時(shí),為了便于實(shí)際操作,對(duì)最佳工藝條件預(yù)測(cè)值修正為黑曲霉Asp.niger菌懸液的量8 mL(1×10-4g/mL)、發(fā)酵溫度33.5 ℃、發(fā)酵時(shí)間72.5 d,其他工藝條條件不變,在此條件下進(jìn)行實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),褐變度可達(dá)到5.62,與理論預(yù)測(cè)值6.68接近程度高,說(shuō)明所用二元擬合模型對(duì)柿子漿發(fā)酵褐變的實(shí)驗(yàn)過(guò)程具有一定的指導(dǎo)作用。

3 結(jié)論

本論文通研究黑曲霉Asp.niger、毛霉M. sp、米曲霉Asp.oryzae、根霉Rhizopussp.這4種真菌接入處理過(guò)得柿子漿中發(fā)酵加工黑柿子,篩選得到最適宜黑柿產(chǎn)品發(fā)酵的微生是黑曲霉Asp.niger,通過(guò)考察黑曲霉Asp.niger菌懸液的量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等3因子,以褐變度為響應(yīng)面值建立方程組和模型,預(yù)測(cè)出最佳發(fā)酵條件:黑曲霉Asp.niger菌懸液的量8 mL、溫度33.5 ℃、時(shí)間72.5 d。在此條件下褐變度可達(dá)到5.62,接近了預(yù)測(cè)值。說(shuō)明此數(shù)學(xué)模型對(duì)褐變度的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確。進(jìn)一步柿子發(fā)酵加工黑色柿子產(chǎn)品和應(yīng)用提供了一定的參考依據(jù),可為黑色柿子產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供技術(shù)借鑒。