(淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,淮北師范大學(xué)信息學(xué)院,資源植物生物學(xué)安徽省重點實驗室,安徽淮北 235000)

女貞子是木犀科植物女貞(LigustrumlucidumAit)的成熟果實,性味甘、苦、涼,歸肝、腎經(jīng),具有補益肝腎、滋陰清熱、明目烏發(fā)等功效,能治療慢性支氣管炎、骨質(zhì)疏松癥[1-2]、急性黃疽型肝炎和慢性病毒性肝炎,具有提高機體免疫力[3]、抗衰老[4]、降血糖[5-6]、調(diào)血脂[6]、抗肥胖[7]、抗腫瘤[3,8]、保肝[9]等作用。熊果酸(Ursolic Acid,UA)和齊墩果酸(Oleanoic Acid,OA)是女貞子發(fā)揮藥理作用的主要有效成分之一[10]。

熊果酸傳統(tǒng)的提取方法有浸提和索氏提取[11]。近年來,超臨界CO2流體萃取[12]、微波提取[13-14]、超聲提取[15]等新技術(shù)應(yīng)用在熊果酸提取及分離純化上。超臨界CO2流體萃取具有選擇性好、提取時間短、提取效率高、產(chǎn)品雜質(zhì)少、萃取劑無毒無害、溶劑用量少、綠色環(huán)保等優(yōu)點,但提取條件要求較高、成本高、高溫高壓,存在安全隱患[16]。超聲提取是利用空化作用導(dǎo)致細(xì)胞破裂,增加溶劑的傳質(zhì),具有提取時間短、提取溫度低及溶劑用量少等特點,但仍存在一些問題而難以大規(guī)模工業(yè)化推廣[17]。微波提取具有時間短、能耗低、效率高、選擇性強、溶劑用量少、環(huán)境污染小等特點[18-20]。一般采用正交設(shè)計或響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取熊果酸工藝。因此,本研究以女貞子為原料,以女貞子中熊果酸提取量為評價指標(biāo),在單因素的試驗基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化分析,從而確定微波輔助提取女貞子中熊果酸的工藝,以期為女貞子深入研究及熊果酸工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

女貞子 采收于淮北師范大學(xué)校區(qū),經(jīng)薛建平教授鑒定為木犀科植物女貞的成熟果實,干燥后經(jīng)超微粉碎機粉碎備用;熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(含量94.7%) 中國藥品生物制品檢定所;無水乙醇、高氯酸、冰醋酸、香草醛等 均為國產(chǎn)分析純。

CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀 上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司;FDV 型超微粉碎機 北京環(huán)亞天元機械技術(shù)有限公司;DU 700 型紫外/可見分光光度計 美國貝克曼公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 女貞子中熊果酸提取方法 分別稱取5.00 g女貞子粉,加入一定濃度的乙醇溶液在一定微波功率下浸提一定時間,靜置冷卻,抽濾后,用85%的乙醇溶液定容至250 mL得含有熊果酸的待測溶液。

1.2.2 女貞子中熊果酸提取單因素研究

1.2.2.1 乙醇濃度的選擇 稱取5.00 g女貞子,按料液比1∶20 g/mL加入65%、70%、75%、80%、85%、90%的乙醇溶液,在微波功率400 W,萃取180 s后,冷卻、抽濾定容得含有熊果酸的待測溶液。

1.2.2.2 微波功率的選擇 稱取5.00 g女貞子,按料液比1∶20 g/mL加入85%的乙醇溶液,分別在100、200、300、400、500、600 W的微波功率下,萃取180 s后,冷卻、抽濾定容得含有熊果酸的待測溶液。

1.2.2.3 料液比的選擇 稱取5.00 g女貞子,按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL的料液比分別加入85%的乙醇溶液,在微波功率400 W下,萃取180 s后,冷卻、抽濾定容得含有熊果酸的待測溶液。

1.2.2.4 浸提時間的選擇 稱取5.00 g女貞子,按料液比1∶20 g/mL加入85%的乙醇溶液,在微波功率400 W下,分別萃取60、90、120、150、180、210、240、270 s后,冷卻、抽濾定容得含有熊果酸的待測溶液。

1.2.3 響應(yīng)面試驗 采用Minitab 15軟件中的Box-Behnken方法設(shè)計試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以乙醇濃度(X1)、微波功率(X2)、液料比(X3)、提取時間(X4)為自變量,以女貞子中熊果酸提取量(Y)為響應(yīng)值,設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗,響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平如表1。

表1 Box-Benhnken響應(yīng)面分析試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in theBox-Benhnken experimental design

表中各自變量編碼值與真實值之間的關(guān)系分別為:x1=(X1-85)/5,x2=(X2-400)/100,x3=(X3-20)/5,x4=(X4-150)/30。

1.2.4 熊果酸含量的測定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的熊果酸標(biāo)品10.00 mg,用無水乙醇溶解并定容至100 mL,得濃度為100 μg/mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL分別置于試管,在85 ℃水浴鍋中揮干溶劑后,加入5%香草醛醋酸溶液0.50 mL及高氯酸1.00 mL搖勻,將試管置于60 ℃水浴中保溫15 min,冷卻至室溫,加入冰醋酸5.0 mL,搖勻后放置15 min顯色,在546 nm波長處測定吸光度[21]。以熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品含量(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得線性回歸方程:A=0.0072C-0.0461,R2=0.9997。

1.2.4.2 女貞子中熊果酸含量的測定 取女貞子提取液1.00 mL置于試管中,在85 ℃水浴鍋中揮干溶劑后,加入5%香草醛醋酸溶液0.50 mL及高氯酸1.00 mL搖勻,將試管置于60 ℃水浴中保溫15 min,冷卻至室溫,加入用冰醋酸5.0 mL,搖勻后放置15 min顯色,在546 nm波長處測定吸光度。根據(jù)線性回歸方程換算成提取液中的熊果酸含量,并按下式計算其熊果酸提取量。

式中:c為提取液中熊果酸含量(mg/mL);V為提取液的總體積(mL);m為女貞子質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的試驗均重復(fù)3次,利用Minitab 15和Excel 2007統(tǒng)計軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對女貞子中熊果酸提取效果的影響

不同乙醇濃度對女貞子中熊果酸提取量的影響結(jié)果如圖1。由圖1可知,女貞子中熊果酸提取量隨乙醇濃度的增大而增加,乙醇濃度為85%時,熊果酸提取量最大,為4.373 mg/g。且根據(jù)相似相溶原理,85%乙醇水溶液的極性與女貞子中熊果酸的極性最接近,所以選取85%為自變量乙醇濃度的零水平。

圖1 乙醇濃度對熊果酸提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentrationon the extraction yield of ursolic acid

2.2 微波功率對女貞子中熊果酸提取效果的影響

不同微波功率對女貞子中熊果酸提取量的影響如圖2。由圖2可知,微波功率低于400 W時,熊果酸提取量隨著微波功率的增大而提高;當(dāng)微波功率超過500 W,熊果酸提取量隨著微波功率的升高而降低。通過對400 W與500 W功率條件下熊果酸提取量的顯著性分析,發(fā)現(xiàn)差異不顯著,因此選取400 W為自變量微波功率的零水平。

圖2 微波功率對熊果酸提取量的影響Fig.2 Effect of microwave poweron the extraction yield of ursolic acid

2.3 料液比對女貞子中熊果酸提取效果的影響

不同料液比對女貞子中熊果酸提取量的影響見圖3。由圖3可知,料液比在1∶10～1∶20 g/mL范圍內(nèi),熊果酸提取量隨料液比的增大而顯著提高(P<0.05),當(dāng)料液比超過1∶20 g/mL時,熊果酸提取量增加的趨勢變緩,這是由于女貞子中熊果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)是一定的。綜合考慮提取溶劑的成本及熊果酸提取液真空濃縮的效率等問題,其料液比控制1∶20 g/mL左右為宜。

圖3 料液比對熊果酸提取量的影響Fig.3 Effect of solid-to-solvent ratioon the extraction yield of ursolic acid

2.4 浸提時間對女貞子中熊果酸提取效果的影響

不同浸提時間對女貞子中熊果酸提取量的影響見圖4。由圖4可知,隨微波時間的增加,熊果酸提取量呈先迅速增加后緩慢降低的趨勢。是因為隨微波時間增加的過程中,女貞子細(xì)胞破裂加劇,熊果酸溶出率提高[22]。當(dāng)浸提時間150 s時,熊果酸提取量達(dá)到最大,所以,選取150 s為自變量時間的零水平。

圖4 浸提時間對熊果酸提取量的影響Fig.4 Effect of extraction timeon the extraction yield of ursolic acid

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化女貞子中熊果酸的提取工藝

2.5.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及回歸模型建立 響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and correspondingresults for response surface analysis

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01);表4同。

表4 回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗Table 4 Significance test of regression coefficients in regression model

2.5.2 方差分析 表3的方差分析表明,該模型極顯著(P<0.01),而失擬項不顯著(P>0.05),表明響應(yīng)值熊果酸提取量實際值與預(yù)測值之間具有較好的相關(guān)性。由表4可知,一次項X1、X2、X3和X4極顯著(P<0.01),說明乙醇濃度、微波功率、液料比和浸提時間對女貞子中熊果酸提取量的影響是極顯著的。交互項X3X4極顯著(P<0.01),說明料液比和浸提時間交互項對女貞子中熊果酸提取量極顯著影響,交互項X1X3和X2X4顯著(P<0.05),說明乙醇濃度和料液比及微波功率和浸提時間交互項對女貞子熊果酸提取量的影響顯著。二次項X12、X22、X32和X42對女貞子中熊果酸提取量的影響也極顯著(P<0.01)。

2.5.3 響應(yīng)面分析 微波輔助提取女貞子中熊果酸的響應(yīng)面和等高線見圖5,從圖5A可知,曲面比較陡峭,說明乙醇濃度、微波功率對熊果酸提取量影響顯著,但兩者的交互作用不顯著(P=0.514),等高線圖接近圓形。從圖5B可知,曲面比較陡峭,同時等高線是橢圓形,說明乙醇濃度、料液比及交互作用對熊果酸提取量影響顯著。從圖5C可知,乙醇濃度與浸提時間對熊果酸提取量影響顯著,但兩者的交互作用不顯著(P=0.148),等高線圖接近圓形。從圖5D可知,料液比與微波功率對熊果酸提取量影響顯著,但兩者的交互作用不顯著(P=0.067),其等高線圖接近圓形。從圖5E和圖5F可知,曲面比較陡峭,等高線呈橢圓形,說明微波功率、浸提時間與料液比及它們交互作用對熊果酸提取量影響顯著。

圖5 熊果酸響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for ursolic acid

2.5.4 女貞子中熊果酸最佳提取工藝條件的確定和實驗驗證 利用Minitab 15軟件對試驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析,獲得熊果酸提取工藝最佳參數(shù):乙醇濃度為88.5%、微波功率為479 W、料液比為1∶23.4 g/mL、微波浸提時間為166 s,女貞子中熊果酸提取量預(yù)測值為4.681 mg/g?？紤]到實際操作的便利,確定女貞子中熊果酸微波輔助提取的工藝參數(shù)為:乙醇濃度為88%、微波功率為480 W、料液比為1∶23 g/mL、微波浸提時間為166 s。為證實預(yù)測的結(jié)果,用試驗中得到的最佳提取工藝參數(shù)做3次平行實驗,其熊果酸平均提取量為(4.653±0.087) mg/g,與預(yù)測值相對誤差為0.47%,說明該方程預(yù)測值與實驗值相吻合。與鄭艷等[23]研究結(jié)果相比,女貞子熊果酸提取量相近,但提取時間由120 min縮短為166 s,因此具有較好應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上,以熊果酸提取量為響應(yīng)值,利用Minitab 15軟件優(yōu)化分析,各因素對女貞子中熊果酸提取量的影響大小順序為:乙醇濃度>浸提時間>微波功率>液料比,其中料液比與浸提時間交互作用極顯著,料液比與乙醇濃度及浸提時間與微波功率交互作用顯著。優(yōu)化后的女貞子中熊果酸提取藝條件為:乙醇濃度88%、微波功率480 W、料液比1∶23 g/mL、微波浸提時間166 s。在此優(yōu)化條件下,女貞子中熊果酸提取量為(4.653±0.087) mg/g。