,4,*

(1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025;2.貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550005;3.貴州茅臺(tái)酒廠(集團(tuán))習(xí)酒有限責(zé)任公司,貴州遵義 564622;4.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心,貴州貴陽(yáng) 550005)

刺梨(RosaroxburghiiTratt)又名茨梨,一種野生小灌木,是西南地區(qū)常見(jiàn)的野生植被,含有大量的酚類化合物,成熟的刺梨果實(shí)表面呈黃色且單寧酸含量高,澀味重。是貴州省種植面積最大的野生果樹(shù)資源[1],果實(shí)含有豐富的維生素C[2]、超氧化物歧化酶(SOD)[3]、類黃酮[4]、以及氨基酸[5]等多種有效物質(zhì),在營(yíng)養(yǎng)、保健和醫(yī)藥方面具有極高的研究利用價(jià)值[6]。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)于刺梨果渣自然發(fā)酵過(guò)程中微生物變化方面研究比較少,刺梨在加工過(guò)程當(dāng)中,品相不佳和有機(jī)械損傷的果子經(jīng)常被丟棄,刺梨果渣作為刺梨果壓榨后的副產(chǎn)物,常作為農(nóng)作物廢棄物,既浪費(fèi)資源又造成環(huán)境污染。利用廢棄的刺梨果渣進(jìn)行發(fā)酵,對(duì)刺梨果渣自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,了解發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌菌群的變化規(guī)律,能更好地為貴州刺梨產(chǎn)業(yè)發(fā)酵方向提供有效的數(shù)據(jù),并且在一定程度上提高刺梨資源利用度,促進(jìn)資源合理利用。

近年來(lái),在微生物群落多樣性研究中分子生物學(xué)研究手段受到重視[7-10],不同環(huán)境下的樣本由于來(lái)源和條件是不可控制的,Illumina Mi Seq高通量測(cè)序技術(shù)(又稱下一代測(cè)序技術(shù))能快速、精準(zhǔn)地了解樣品之間菌群的構(gòu)成和功能分析以及菌群之間的差異性,該技術(shù)在微生物分子生態(tài)學(xué)[11]、病原生物學(xué)[12]、食源性病原體快速檢測(cè)[13]等應(yīng)用廣泛。高通量測(cè)序技術(shù)不需要對(duì)樣本中的微生物進(jìn)行分離純化,可直接對(duì)樣本中基因組DNA進(jìn)行分析,能一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定,有效反映出菌群物種豐度和差異性[14-17]。

因此本研究利用Illumina Mi Seq高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)自然發(fā)酵刺梨果渣中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)及多樣性,為刺梨發(fā)酵工業(yè)提供有利的菌種資源,同時(shí)為后期刺梨發(fā)酵技術(shù)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨 采自貴州省龍里縣刺梨種植基地;紅糖 市購(gòu);DNA抽提試劑盒(E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit) 美國(guó)歐米茄公司;Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒 美國(guó)生命技術(shù)公司;2×Taq Master Mix 南京諾唯贊生物科技有限公司;MagicPure Size Selection DNA Beads 北京全式金生物科技有限公司;細(xì)菌通用引物(341F,805R) 生工生物工程(上海)股份有限公司。

Pico-21臺(tái)式離心機(jī) 賽默飛世爾科技公司;GL-88B漩渦混合器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;TND03-H-H混勻型干式恒溫器 深圳拓能達(dá)科技有限公司;DYY-6C電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽 北京市六一儀器廠;凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP;T100TM Thermal Cyele PCR儀 美國(guó)伯樂(lè)公司;Q32866Qubit? 3.0熒光計(jì) 美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 刺梨發(fā)酵液制備 先將10 L的白色塑料桶用75%的酒精經(jīng)表面殺菌后備用,將榨汁后(刺梨果出汁率約為60%)的刺梨果粉碎,參照朱麗梅[18]等方法,將刺梨果渣、水、紅糖按3∶10∶1的比例裝在塑料桶中,搖勻,密封發(fā)酵,每隔6 d放一次氣攪拌并取樣,連續(xù)發(fā)酵60 d。

1.2.2 樣品總DNA的提取 樣品前處理:取2 mL發(fā)酵液樣品,加入到已滅菌的離心管中,在10000 r/min離心3 min,棄上層液,沉淀倒置吸水紙上1 min,濾干。

樣品總DNA的提取:具體提取步驟參照OMEGA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作,然后再利用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性,再進(jìn)行下一步分析。

1.2.3 細(xì)菌16S rDNA基因PCR擴(kuò)增 利用DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量,以確定PCR反應(yīng)需要加入的DNA量。PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3-V4通用引物(341F,805R)[19]。

將配置好的PCR體系(30 μL體系)按照下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性處理30 s,45 ℃退火20 s,65 ℃延伸30 s,5個(gè)循環(huán);94 ℃變性處理20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,20個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min。PCR結(jié)束后進(jìn)行第二輪擴(kuò)增,引入Illumina橋式PCR兼容引物,配置好的PCR體系(30 μL體系)按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增:95 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性處理20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,5個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min,降溫到10 ℃。擴(kuò)增完成后,回收PCR產(chǎn)物并純化。

1.2.4 Illumina Mi Seq高通量測(cè)序 將所得到的PCR產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行高通量建庫(kù)和細(xì)菌多樣性分析。測(cè)序完成后進(jìn)行DNA序列拼接和質(zhì)量控制,并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行生物學(xué)信息分析[20]。

1.2.5 多樣性分析 根據(jù)OTU聚類分析的結(jié)果,采用Mothur在OTU相似水平在97%的條件下計(jì)算多樣性指數(shù),包括OTU數(shù)量、香農(nóng)指數(shù)、Chao1指數(shù)、森普森指數(shù)、Ace指數(shù)和覆蓋率指數(shù)[21]。

1.2.6 群落組成分析 利用blastn將OTU序列與相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),觀測(cè)樣品在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu),篩選出OTU序列的最適比對(duì)結(jié)果并在默認(rèn)滿足相似度>90%的基礎(chǔ)上,選取不同分類水平上的細(xì)菌群落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,根據(jù)分析結(jié)果,利用軟件繪制所有樣本群落結(jié)構(gòu)分布柱狀圖、物種可視化圈圖等進(jìn)行群落組成分析[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用R語(yǔ)言和mothur(https://mothur. org/wiki/Chao/Ace/Shannon/Simpson/Coverage)軟件進(jìn)行分析,利用cutadapt(https://pypi.org/project/cutadapt/1.2.1/)去除接頭,PEAR(https://cme.h-its.org/exelixis/web/software/pear/)進(jìn)行序列對(duì)拼,Prinseq(http://prinseq.sourceforge.net/)質(zhì)量剪切。測(cè)序獲得的基因序列與Silva[23](http://www.arb-silva.de/)、NCBI 16S(http://ncbi.nlm.nih.gov/)、RDPhttp://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

表1 質(zhì)量控制后序列統(tǒng)計(jì)總表Table 1 Summary of sequence statistics after quality control

表2 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表Table 2 Alpha diversity index statistical

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定

由圖1瓊脂糖凝膠電泳可知,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶均在584 bp左右,且條帶長(zhǎng)度和亮度較好,表明DNA含量較高,可繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 發(fā)酵刺梨果渣細(xì)菌群落16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCRamplified product of bacterial communityin fermented Pyrus spinosa fruit residue注：點(diǎn)樣順序(從左到右):Marker,時(shí)間為6、12、18、24、30、36、42、48、54和60 d,Marker。

2.2 物種多樣性分析

測(cè)序數(shù)據(jù)QC(質(zhì)量控制)之后序列統(tǒng)計(jì)如表1所示,原始reads總數(shù)目為689755,QC之后剩余reads總數(shù)目為665308條優(yōu)質(zhì)條帶。通過(guò)繪制OTU數(shù)目變化與聚類similarity值之間的關(guān)系圖,similarity數(shù)值達(dá)0.97%可進(jìn)行下一步分析[24]。

Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)如表2所示,刺梨果渣在分別發(fā)酵6、12、18、24、30、36、42、48、54和60 d時(shí)間點(diǎn)上,10個(gè)樣品的OTU數(shù)量和ACE指數(shù)在發(fā)酵6和12 d總體變化不大;ACE指數(shù)用來(lái)估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù),ACE指數(shù)在12和18 d值最大,表明了12～18 d隨著發(fā)酵的進(jìn)行發(fā)酵刺梨果渣中細(xì)菌群落豐度逐漸增大;發(fā)酵24 d以后樣本中的OTU數(shù)量和ACE指數(shù)開(kāi)始下降;在發(fā)酵54 d時(shí)Ace指數(shù)最大,達(dá)1311.29,說(shuō)明發(fā)酵到第54 d時(shí)已達(dá)到發(fā)酵的最高時(shí)期,發(fā)酵最后60 d物種多樣性開(kāi)始下降。香農(nóng)指數(shù)用來(lái)反映微生物多樣性,指數(shù)越大,群落多樣性越高,對(duì)10個(gè)樣本中的香農(nóng)指數(shù)隨著發(fā)酵時(shí)間的變化可知,在發(fā)酵6 d時(shí)香農(nóng)指數(shù)較高,其次是12 d,表明剛開(kāi)始發(fā)酵到12 d時(shí),刺梨果渣中細(xì)菌群落多樣性逐漸增高,其余發(fā)酵時(shí)間香農(nóng)指數(shù)相對(duì)較穩(wěn)定。森普森指數(shù)用于估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一,森普森指數(shù)值越大,說(shuō)明群落多樣性越低,由表2可知,發(fā)酵到18 d時(shí)樣本多樣性最低。發(fā)酵過(guò)程中10個(gè)樣本的覆蓋率均在99%以上,甚至在發(fā)酵18、24、和30 d時(shí)覆蓋率達(dá)100%,表明了測(cè)序的數(shù)據(jù)能夠覆蓋目前狀態(tài)下樣品中的細(xì)菌種類,測(cè)序量已經(jīng)達(dá)到最大值,能夠真實(shí)映射樣本中的細(xì)菌群落情況,可以用于后續(xù)的分析。Chao1指數(shù)在發(fā)酵前6、12和18 d時(shí)值最高,一般Chao1指數(shù)在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù),細(xì)菌群落物種總數(shù)最高,說(shuō)明該階段的細(xì)菌群落最豐富;后期Chao1指數(shù)趨于穩(wěn)定,表明發(fā)酵后期細(xì)菌群落物種趨于穩(wěn)定。

2.3 物種組成分析

在門(mén)分類水平上,10個(gè)樣本中共檢測(cè)到26個(gè)門(mén)類,其中主要列出前10門(mén)類中占優(yōu)勢(shì)的四個(gè)細(xì)菌門(mén)如圖2所示,分別為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和擬桿菌門(mén)(Actinobacteria)。變形菌門(mén)(Proteobacteria)是整個(gè)刺梨果渣發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén),發(fā)酵起始的平均相對(duì)豐度為80.36%,發(fā)酵30 d達(dá)99.68%,發(fā)酵60 d為99.85%,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,相對(duì)豐度先升高后趨于穩(wěn)定。厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和擬桿菌門(mén)(Actinobacteria)在發(fā)酵初期比例不大,但一直存在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程當(dāng)中。

圖2 細(xì)菌門(mén)類水平的比較Fig.2 Comparison of bacterial taxa levels

在屬分類水平上,在10個(gè)樣本中共檢測(cè)到373個(gè)細(xì)菌屬,其中只列出主要的10個(gè)屬類進(jìn)行分析,如圖3所示。葡糖桿菌屬(Gluconobacter)和醋酸桿菌屬(Acetobacter)是刺梨果渣發(fā)酵過(guò)程中占主要的優(yōu)勢(shì)菌株。發(fā)酵到6 d時(shí)醋酸桿菌屬(Acetobacter)為0,很有可能因?yàn)樽匀话l(fā)酵過(guò)程中伴隨微量的酒精產(chǎn)生,使發(fā)酵后期醋酸桿菌屬快速生長(zhǎng),并隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸升高,發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定。塔特姆菌屬(Tatumella)和鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)在發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度逐漸降低,但在發(fā)酵過(guò)程中一直存在。

圖3 細(xì)菌屬分類水平的比較Fig.3 Comparison of taxonomic levels of bacterial genera

2.3 物種的優(yōu)勢(shì)菌群可視化分析

在Genus水平上對(duì)發(fā)酵過(guò)程中10個(gè)樣本微生物豐度的可視化分析如圖4所示,在樣本與物種的共線性關(guān)系圖中,右邊半圓表示樣本的物種豐度組成情況,左邊半圓表示在該分類水平下物種在不同樣本中的分布比例情況。為了顯示效果,僅顯示前10個(gè)樣本和豐度最高的前10個(gè)物種。在圖4中可以直接看出葡糖桿菌屬是絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌,發(fā)酵6 d時(shí)該菌種豐度僅占8.85%,隨著發(fā)酵進(jìn)行,葡糖桿菌屬逐漸升高,發(fā)酵24 d時(shí)豐度達(dá)到83.79%,后期趨于穩(wěn)定,發(fā)酵結(jié)束后豐度達(dá)65.37%。醋酸桿菌屬在開(kāi)始6 d時(shí)沒(méi)有生長(zhǎng),18 d為9.22%,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),最后值豐度數(shù)值達(dá)33.86%。

圖4 Genus水平上樣本與物種關(guān)系圖Fig.4 Sample-species relationship at genus level

2.4 細(xì)菌群落的主成分分析

對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的10個(gè)樣本減化數(shù)據(jù)分析后,在相對(duì)應(yīng)的坐標(biāo)點(diǎn)上有效地找出數(shù)據(jù)中最主要的變量信息,根據(jù)各樣本間點(diǎn)的聚集程度和距離,樣本間距離越近,說(shuō)明10個(gè)樣本的微生物群落相似度越高。由圖5可知,刺梨果渣發(fā)酵6 d、42和54 d時(shí)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其它發(fā)酵時(shí)期有明顯差異。在主成分1(PC1)和主成分2(PC2)數(shù)據(jù)集中,對(duì)樣本方差的貢獻(xiàn)率最大,分別達(dá)到了62%和32%,共計(jì)94%,并且可以代表刺梨發(fā)酵過(guò)程中微生物變化的絕大部分變量信息,并且刺梨果渣細(xì)菌群落隨發(fā)酵時(shí)間的變化過(guò)程主要是在PC1和PC2軸上,因此可以將刺梨果渣發(fā)酵分為2個(gè)時(shí)間段:第1時(shí)間段為發(fā)酵初期(6～24 d),第2時(shí)間段為發(fā)酵后期(30～60 d)。這種分類表明刺梨果渣在發(fā)酵前后細(xì)菌群落有一定的差異,發(fā)酵前期細(xì)菌群落豐富,隨著進(jìn)入發(fā)酵后期,葡糖桿菌屬占取絕對(duì)優(yōu)勢(shì),醋酸菌屬其次,這種差異為建立發(fā)酵刺梨果渣的監(jiān)控模型奠定了一定基礎(chǔ)。

圖5 10個(gè)樣本基于OTU的PCA圖Fig.5 PCA Diagram of 10 samples based on OTU

3 結(jié)論

本文采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)貴州省龍里縣刺梨種植基地的刺梨果渣在自然發(fā)酵過(guò)程中(0～60 d)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析,分析共檢測(cè)出24個(gè)門(mén)類、40個(gè)綱類群、74個(gè)目類群、162個(gè)科類群、373個(gè)屬類群。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,主要以葡糖桿菌屬和醋酸桿菌屬為主。雖然發(fā)酵后期葡糖桿菌屬和醋酸菌屬大量生長(zhǎng)繁殖,成為整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群,使其它細(xì)菌相對(duì)豐度降低,但這些菌群在發(fā)酵過(guò)程中一直存在,所以總體上細(xì)菌的多樣性變化趨勢(shì)并不大,這很大程度上有可能是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程一直處于密封環(huán)境中,容器中的微量氧氣慢慢被消耗,發(fā)酵后期逐漸形成厭氧環(huán)境,微好氧菌快速繁殖,抑制其它菌群生長(zhǎng),使菌群中比例占優(yōu)勢(shì)的好氧菌大量減少而造成的[25]。

通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)可以全面掌握刺梨果渣發(fā)酵過(guò)程中微生物的多樣性和豐度變化,在一定程度上了解刺梨果渣自然發(fā)酵過(guò)程中的微生物菌群結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,為今后發(fā)酵刺梨果渣的菌株篩選和發(fā)酵工藝奠定基礎(chǔ)。