,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014)

陰溝腸桿菌是一種革蘭氏陰性短桿菌,廣泛存在于環(huán)境和動(dòng)物腸道中的條件致病菌,同時(shí)也是肉制品中的一種主要腐敗菌,同肉制品中分離得到的多數(shù)腐敗菌相比,該菌具有很強(qiáng)的生物膜形成能力[1-2]。自1978年Costerton首先發(fā)現(xiàn)并提出了生物膜(biofilm)理論以來(lái)[3]。研究發(fā)現(xiàn)引起人類(lèi)、畜禽疾病的許多細(xì)菌都可以形成生物膜[4-5],在食品加工生產(chǎn)中,多數(shù)食源性致病菌可以在不同的加工材料表面形成生物膜,以生物膜形式存在的致病菌,耐受性更強(qiáng),在加工過(guò)程中固著在加工設(shè)備表面成為潛在的污染源[6-9],中國(guó)食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)的調(diào)查結(jié)果顯示,27%微生物污染來(lái)自于食品加工設(shè)備等造成的交叉污染,是最主要的污染途徑[10]。林學(xué)海[11]等對(duì)嬰幼兒食品生產(chǎn)環(huán)境中可能存在的陰溝腸桿菌污染點(diǎn)取樣并進(jìn)行了溯源分析,發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)環(huán)境可能成為陰溝腸桿菌二次污染源,原料品中污染的陰溝腸桿菌經(jīng)過(guò)一系列工序加工后,仍然存在于后續(xù)半成品或成品中。

近年來(lái),植物精油作為開(kāi)發(fā)天然食品防腐和抑菌物質(zhì)的主要來(lái)源而受到食品加工工業(yè)的關(guān)注,百里香酚是牛至和百里香等植物精油的主要成分,大量研究表明,百里香酚對(duì)食源性致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌[12]、沙門(mén)氏菌[13-14]、紫色色桿菌[15]等有抑菌作用并且對(duì)其生物膜的形成有抑制作用。百里香酚目前已被歐盟委員會(huì)認(rèn)定可作為食品中的調(diào)味劑(Regulation EU 872/2012),且被美國(guó)食品藥品管理局認(rèn)定為公認(rèn)安全的食品添加劑(21 CFR 182.60)。但百里香酚對(duì)食源性致病菌陰溝腸桿菌生物膜的抑制作用國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以從低溫肉制品中分離的優(yōu)勢(shì)腐敗菌陰溝腸桿菌C4為研究對(duì)象,研究百里香酚在亞抑菌濃度下對(duì)陰溝腸桿菌生物膜形成的抑制作用。為低溫食品的防腐保鮮新技術(shù)開(kāi)發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

陰溝腸桿菌C4 為本實(shí)驗(yàn)室從低溫肉制品中分離并保存;百里香酚(純度>99%) 由湖北鑫潤(rùn)德化工有限公司提取自植物百里香;胰蛋白胨大豆肉湯(Trypticase Soy Broth TSB)培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司;NuncTMLab-TekTM8孔腔室蓋玻片 美國(guó)賽默飛;LIVE/DEAD Bac LightTM試劑盒 美國(guó)賽默飛;Costar 24孔/96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)Corning公司;RNA prep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司;Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒 TaKaRa。

Bio Photo meter plus核酸蛋白測(cè)定儀 德國(guó) Eppendorf;EVO-LS10掃描電子顯微鏡 德國(guó)蔡司;PE(Ultra View VOX)轉(zhuǎn)盤(pán)式激光共聚焦顯微鏡 鉑金埃爾默公司;Gen5 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)博騰。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化和配制百里香酚溶液 將陰溝腸桿菌C4接種于TSB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后在TSB瓊脂平板上劃線,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑選典型單菌落接種到5 mL新鮮TSB培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,制成含40%甘油的菌懸液,凍存在-40 ℃冰箱中。每次試驗(yàn)前,取凍存的菌液1%接種于5 mL 新鮮TSB培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min活化12 h備用。百里香酚使用無(wú)水乙醇配制濃度為20480 μg/mL的母液置于4 ℃ 冰箱中,后續(xù)每次試驗(yàn)前稀釋備用并使用0.22 μm 濾膜過(guò)濾。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將活化后的菌液按照1%接種到5 mL新鮮TSB培養(yǎng)基中,加入過(guò)濾后的百里香酚,菌液和百里香酚按比例混合,二倍稀釋法,試管內(nèi)百里香酚終濃度分別為256、128、64、32 μg/mL,對(duì)照組為未加入百里香酚的菌液。37 ℃,200 r/min,每隔2 h取各梯度菌液200 μL加入到96孔板中,Gen5全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定24 h內(nèi)孔內(nèi)吸光度OD600值,繪制陰溝腸桿菌生長(zhǎng)曲線,確定百里香酚對(duì)陰溝腸桿菌C4的MIC。

1.2.3 對(duì)陰溝腸桿菌C4泳動(dòng)能力的抑制作用 采用軟瓊脂平板法[16-18]測(cè)定泳動(dòng)能力(swimming和swarming),分別配制swimming培養(yǎng)基(10 g/L胰蛋白胨、5 g/L氯化鈉、2.5 g/L葡萄糖和0.3%瓊脂)和swarming培養(yǎng)基(25 g/L LB培養(yǎng)基、0.5 g/L葡萄糖和0.5%瓊脂),高溫滅菌冷卻至60 ℃以下后加入百里香酚母液,使其培養(yǎng)基內(nèi)百里香酚濃度為32、64、128 μg/mL,對(duì)照組為不添加百里香酚的培養(yǎng)基。取活化后的菌液1%接種到5 mL新鮮TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,12000×g離心5 min,移除上清液,無(wú)菌PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌三次,用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液的OD600為0.8～1.0之間,每個(gè)配制的平板中心表面滴加3 μL菌懸液,分別于37 ℃下靜置培養(yǎng)8、20 h。拍照測(cè)定細(xì)菌擴(kuò)散菌圈的直徑大小。

1.2.4 對(duì)陰溝腸桿菌C4生物膜形成的抑制作用

1.2.4.1 對(duì)生物膜內(nèi)活菌總數(shù)的測(cè)定 按1.2.2的方法配制百里香酚終濃度為32、64、128 μg/mL的菌液,對(duì)照組為不添加百里香酚的菌液,24孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔添加1 mL不同濃度的菌液,分別培養(yǎng)至12、24、48、72 h,每隔24 h更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)至待測(cè)時(shí)間點(diǎn),將上層培養(yǎng)基緩慢吸出,無(wú)菌PBS緩沖液(pH=7.4)輕柔洗滌兩次并吸出多余緩沖液,每孔添加1 mL無(wú)菌生理鹽水,采用無(wú)菌棉簽仔細(xì)擦洗孔壁及孔底邊緣處的生物膜,將棉簽及孔內(nèi)液體全部轉(zhuǎn)移到9 mL無(wú)菌生理鹽水試管中,渦旋震蕩5 min,便于使棉簽上附著的及生物膜內(nèi)包裹的細(xì)菌充分游離到液體中[19]。10倍梯度稀釋至適宜梯度,吸取100 μL液體到瓊脂平板上,涂布均勻于恒溫培養(yǎng)箱,37 ℃,靜置培養(yǎng)24 h,菌落計(jì)數(shù)。

1.2.4.2 對(duì)生物膜胞外多糖的含量測(cè)定 按1.2.2的方法配制百里香酚終濃度為32、64、128 μg/mL的菌液,對(duì)照組為不添加百里香酚的培養(yǎng)基,24孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔添加1 mL不同梯度的菌液,分別培養(yǎng)至12、24、48、72 h,每隔24 h更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)至待測(cè)時(shí)間點(diǎn),將上層培養(yǎng)基緩慢吸出,無(wú)菌PBS緩沖液(pH=7.4)輕柔洗滌兩次并吸出多余緩沖液,每孔添加1 mL無(wú)菌PBS緩沖液(pH=7.4),沖洗培養(yǎng)孔中的生物膜并收集溶液,4 ℃,5000×g離心20 min,收集菌泥,0.85%(v/v)NaCl水溶液(0.22%(v/v)甲醛)重懸菌泥,80 ℃,加熱30 min,將加熱后的菌懸液4 ℃,15000×g 離心30 min,收集上清液備用[19]。使用苯酚-硫酸法測(cè)定生物膜胞外多糖的含量[20]。

1.2.5 對(duì)陰溝腸桿菌C4生物膜微觀狀態(tài)的影響

1.2.5.1 掃描電鏡(SEM)觀察 SEM可以用于觀察不同時(shí)間點(diǎn)生物膜內(nèi)菌體聚集后的微觀狀態(tài)。按1.2.2的方法配制百里香酚濃度為1/4 MIC(64 μg/mL)的菌液,對(duì)照組為不添加百里香酚的菌液,NuncTMLab-TekTM8孔腔室蓋玻片中每孔添加400 μL菌液,分別培養(yǎng)至12、24、48、72 h,每隔24 h更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)至待測(cè)時(shí)間點(diǎn),將上層培養(yǎng)基緩慢吸出,無(wú)菌PBS緩沖液(pH=7.4)輕柔洗滌兩次并吸出多余緩沖液,室溫晾干,去除上層隔板,將載玻片按照樣品區(qū)間切割后,2.5%(v/v)戊二醛溶液浸泡,4 ℃固定12 h后晾干,使用1%(v/v)的鋨酸固定90 min,然后使用含量為30%、50%、80%、90%、100%(v/v)乙醇溶液梯度脫水[21],每次10 min,然后再使用100%(v/v)叔丁醇洗滌。將處理后的玻片噴金用于SEM觀察,拍照時(shí)選取放大倍數(shù)為5000倍[22]。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence for real-time PCR

1.2.5.2 激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察 CLSM可以用來(lái)觀察不同培養(yǎng)時(shí)間下生物膜成膜厚度的變化。按1.2.2的方法配制梯度為1/4 MIC(64 μg/mL)的菌液,對(duì)照組為不含百里香酚的菌液,NuncTMLab-TekTM8孔腔室蓋玻片中每孔添加400 μL菌液,分別培養(yǎng)至12、24、48、72 h,每隔24 h更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)至待測(cè)時(shí)間點(diǎn),將上層培養(yǎng)基緩慢吸出,無(wú)菌PBS緩沖液(pH=7.4)輕柔洗滌兩次并吸出多余緩沖液,室溫晾干。使用LIVE/DEAD Bac LightTM試劑盒對(duì)生物膜進(jìn)行染色,試劑盒中含有的探針SYTO-9與探針PI能使活、死細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下呈現(xiàn)綠色、紅色熒光,配制染色液,每1 mL無(wú)菌 PBS溶液(pH=7.4)中分別加入3 μL試劑盒中的兩種染液,染液現(xiàn)配現(xiàn)用并避光保存。在晾干的8孔腔室板中每孔加入染色液400 μL,避光染色30 min,吸除染液后使用無(wú)菌PBS溶液(pH=7.4)洗去多余探針,室溫晾干,加入2.5%(v/v)戊二醛溶液固定30 min,吸除戊二醛后室溫晾干,去除上層腔室隔板,在底板樣品表面滴加Bac LightTMMounting Oil,加蓋玻片,-20 ℃避光保存用于CLSM觀察。觀察時(shí)SYTO-9激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為485和498 nm,PI的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為535和637 nm,選取60倍油鏡[22-23]。

1.2.6 對(duì)陰溝腸桿菌C4生物相關(guān)基因表達(dá)量的影響 按1.2.2方法制備處理組為百里香酚濃度為1/4 MIC(64 μg/mL)的菌液,對(duì)照組為不添加百里香酚的菌液,每孔1 mL菌液滴加到24孔板中,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,移除上層培養(yǎng)基并洗滌后每孔加入1 mL無(wú)菌PBS溶液,充分將孔壁及孔底生物膜沖洗溶于液體中,12000×g,4 ℃離心2 min,收集菌泥,使用RNA prep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取試劑盒按照說(shuō)明提取菌體總RNA后,立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL,其中5×PrimeScript RT Master Mix混合液6 μL、RNA10 μL和RNase Free ddH2O 14 μL。反應(yīng)條件:37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s;4 ℃ hold。反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA存放在-20 ℃冰箱中。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL,其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 L、引物2 μL、cDNA 2 μL、RNase Free ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s預(yù)變性;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán);95 ℃ 5 s,60 ℃ 60 s 1個(gè)循環(huán);50 ℃ 30 s延伸。表1為熒光定量PCR引物序列,目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)采用2-ΔΔCt法評(píng)估目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)變化,ΔΔCt=Ct處理組(Ct目標(biāo)基因-Ct管家基因)-Ct對(duì)照組(Ct目標(biāo)基因-Ct管家基因),以Log2(2-ΔΔCt)>1或Log2(2-ΔΔCt)<-1做為基因高表達(dá)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)三次,以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示,試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Statistix 8.0軟件進(jìn)行顯著性分析,(P<0.05為差異顯著)。圖片處理使用Origin 9.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)陰溝腸桿菌C4的最小抑菌濃度(MIC)及生長(zhǎng)曲線

圖2 百里香酚對(duì)陰溝腸桿菌C4泳動(dòng)能力的影響Fig.2 Effect of thymol on mobile ability of E. cloacae C4注:A:菌體泳動(dòng)照片;B:Swimming泳動(dòng);C:Swarming泳動(dòng);大寫(xiě)字母不同代表不同濃度百里香酚處理差異性顯著(P<0.05)。

圖1表示不同濃度百里香酚處理下陰溝腸桿菌C4的生長(zhǎng)曲線,如圖所示百里香酚對(duì)陰溝腸桿菌C4的最小抑菌濃度為256 μg/mL。當(dāng)采用質(zhì)量濃度為256 μg/mL的百里香酚處理時(shí),陰溝腸桿菌C4生長(zhǎng)過(guò)程被完全抑制;質(zhì)量濃度為128 μg/mL的百里香酚處理時(shí),抑制部分細(xì)菌的生長(zhǎng),細(xì)菌的最大生長(zhǎng)量低于對(duì)照組;64和32 μg/mL百里香酚處理時(shí),生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05),不會(huì)影響浮游狀態(tài)下陰溝腸桿菌C4的生長(zhǎng)。

圖1 陰溝腸桿菌C4生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of E. cloacae C4

2.2 百里香酚對(duì)陰溝腸桿菌C4泳動(dòng)能力的抑制

圖2表示百里香酚對(duì)菌株泳動(dòng)能力(swarming和swimming)的影響。菌體的泳動(dòng)能力分為兩種,swarming代表群體菌體運(yùn)動(dòng)行為,swimming代表單一菌體運(yùn)動(dòng)行為。在本實(shí)驗(yàn)中百里香酚對(duì)菌體swarming能力有劑量反應(yīng)趨勢(shì),百里香酚處理組濃度越高對(duì)swarming能力影響越大;如圖2B所示,對(duì)菌體swimming能力的影響,1/4 MIC和1/8 MIC百里香酚處理組之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。使用1/2 MIC處理時(shí),菌體swimming能力被完全抑制。菌體的泳動(dòng)能力受細(xì)菌鞭毛介導(dǎo),而鞭毛運(yùn)動(dòng)在菌體的初始粘附和生物膜形成過(guò)程中扮演重要角色[24-26],實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明百里香酚顯著降低菌體的泳動(dòng)能力,可能會(huì)影響細(xì)菌生物膜的形成。

2.3 對(duì)陰溝腸桿菌C4生物膜形成的影響

2.3.1 生物膜內(nèi)菌數(shù)的變化 圖3反映百里香酚在72 h內(nèi)對(duì)陰溝腸桿菌C4生物膜內(nèi)活菌總數(shù)的影響。32和64 μg/mL百里香酚處理組和對(duì)照組之間活菌總數(shù)沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),128 μg/mL百里香酚在12、24 h取樣點(diǎn)生物膜內(nèi)活菌總數(shù)顯著(P<0.05)低于其他濃度處理組和對(duì)照組。培養(yǎng)至48 h之后與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05),結(jié)合圖1百里香酚對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響分析,可能128 μg/mL百里香酚在生物膜形成初期影響細(xì)菌的增殖,而隨著細(xì)菌生物膜的成熟,生物膜結(jié)構(gòu)對(duì)膜內(nèi)細(xì)菌有保護(hù)作用,百里香酚在此濃度下失去了對(duì)生物膜內(nèi)細(xì)菌增長(zhǎng)的抑制作用。

圖3 百里香酚對(duì)陰溝腸桿菌C4生物膜內(nèi)菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of thymol on the bacterial countsin E. cloacae C4 biofilm注:大寫(xiě)字母不同代表相同處理濃度在不同時(shí)間點(diǎn)差異顯著;小寫(xiě)字母不同代表在相同時(shí)間點(diǎn)不同處理濃度顯著差異(P<0.05);圖4同。

2.3.2 生物膜內(nèi)胞外多糖含量的變化 胞外多糖是細(xì)菌生物膜維持其三維結(jié)構(gòu)的主要成分,既是生物膜結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ),又是功能的主要承擔(dān)者[27-28]。因此,抑制或減少細(xì)菌胞外多糖的合成和分泌,是抑制生物膜形成的重要手段。通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)定葡萄糖糖濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線作為后期胞外多糖定量標(biāo)準(zhǔn)。線性關(guān)系y=0.0086x+0.0753(R2=0.99),如圖4所示,對(duì)照組胞外多糖含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,說(shuō)明在生物膜的形成過(guò)程中,不斷分泌胞外多糖增加生物膜的穩(wěn)定性,提高對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)力。64和128 μg/mL香芹酚處理組胞外多糖含量在不同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),百里香酚處理組濃度越高,抑制生物膜胞外多糖分泌效果越好。

圖4 百里香酚對(duì)陰溝腸桿菌C4生物膜胞外多糖合成的影響Fig.4 Effect of thymol on exopolysaccharide ofE. cloacae C4 biofilm

2.4 對(duì)陰溝腸桿菌C4生物膜微觀狀態(tài)的影響

圖6 百里香酚對(duì)陰溝腸桿菌C4生物膜的抑制作用Fig.6 Effect of thymol on biofilm of E. cloacae C4 注:A:對(duì)照組 B:64 μg/mL百里香酚處理組。

2.4.1 SEM觀察生物膜內(nèi)菌體聚集后的微觀狀態(tài) 圖5表示SEM觀察陰溝腸桿菌C4生物菌膜內(nèi)菌體的聚集狀態(tài),培養(yǎng)至12 h時(shí),處理組和對(duì)照組均呈單層粘附,處理組菌體之間無(wú)連接,處理組單層排列,觀察到視野內(nèi)單個(gè)菌體桿狀變長(zhǎng);培養(yǎng)至24 h時(shí),處理組菌體之間互相黏連,依然呈單層排列,對(duì)照組菌體之間出現(xiàn)聚集體,形成多層結(jié)構(gòu);培養(yǎng)至48 h之后,對(duì)照組和處理組生物膜成熟,菌體多層包裹在一起,觀察到胞外基質(zhì)的形成,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),生物膜結(jié)構(gòu)越復(fù)雜。

圖5 百里香酚對(duì)陰溝腸桿菌C4生物膜菌體聚集狀態(tài)的影響(5000×)Fig.5 Effect of thymol on cell aggregationin E. cloacae C4 biofilm(5000×)注:A:對(duì)照組 B:64 μg/mL百里香酚處理組。

2.4.2 CLSM觀察生物膜成膜厚度的變化 如圖6所示,使用CLSM觀察百里香酚對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間陰溝腸桿菌C4生物膜成膜厚度的影響,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和處理組生物膜隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,生物膜厚度不斷加厚,膜結(jié)構(gòu)越來(lái)越緊密平整,64 μg/mL百里香酚處理的生物膜與同時(shí)間段的對(duì)照組相比,成膜厚度降低,生物膜有不平整、膜結(jié)構(gòu)松散。

2.5 對(duì)陰溝腸桿菌C4生物膜相關(guān)基因表達(dá)量的影響

圖7表示64 μg/mL百里香酚處理后陰溝腸桿菌C4與生物膜相關(guān)基因的表達(dá)量變化,培養(yǎng)24 h之后,與生物膜形成相關(guān)的6個(gè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量高表達(dá)下調(diào)((Log22-ΔΔCt)<-1);csgB、csgE、csgF是生物膜粘附相關(guān)基因,wcaA、wcaM、wza是與胞外多糖合成相關(guān)基因,這些目的基因均下調(diào)與前邊的生物膜表征變化相一致,進(jìn)一步說(shuō)明百里香酚抑制生物膜形成主要通過(guò)影響生物膜的初始粘附過(guò)程和減少胞外多糖的合成。

圖7 陰溝腸桿菌C4生物膜內(nèi)菌體細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)量變化Fig.7 Changes of relative expression levels ofbiofilm-related genes in E.cloacae C4

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選取的百里香酚(64 μg/mL)在不影響浮游細(xì)菌生長(zhǎng)的情況下有效抑制陰溝腸桿菌C4生物膜的形成,避免增加細(xì)菌的耐藥性;對(duì)照組和64 μg/mL處理組的生物膜內(nèi)活菌總數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05),說(shuō)明百里香酚的抑制作用跟生物膜內(nèi)粘附菌數(shù)沒(méi)有關(guān)系;SEM和CLSM觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)百里香酚處理后,與對(duì)照組相比,細(xì)菌菌體形狀變長(zhǎng),生物膜聚集體形成緩慢,菌體之間連接不緊密,生物膜厚度降低。百里香酚可以顯著(P<0.05)抑制菌體泳動(dòng)能力和胞外多糖的合成,并且與此相關(guān)功能基因的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)表明,百里香酚通過(guò)調(diào)控生物膜相關(guān)功能基因的表達(dá)來(lái)抑制陰溝腸桿菌生物膜的形成,而關(guān)于百里香酚如何具體影響鞭毛介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)的調(diào)控通路和胞外多糖合成的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。