劉娜麗,李久長2,郭春燕3,郭 蕓

(1.山西藥科職業(yè)學(xué)院,山西太原 030031;2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006;3.山西省生物研究院有限公司,山西太原 030006)

金耳(Tremellaaurantialba),又稱腦耳、黃木耳等,為真菌界擔(dān)子菌門擔(dān)子菌綱銀耳目銀耳科銀耳屬黃木耳的子實體,是一種營養(yǎng)價值較高的食藥兼用菌[1]。有人提出金耳是“中國最新發(fā)現(xiàn)最有價值之大補(bǔ)品”。金耳富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分,雖然蛋白質(zhì)含量不高,但人體所必需的8種氨基酸氨基酸含量豐富,比例接近人體需要[2]。除了具有高的營養(yǎng)價值,金耳還具有抗氧化[3-4]、提高機(jī)體免疫力[5]、調(diào)節(jié)血糖、降血脂、降膽固醇、保護(hù)肝臟、抗腫瘤[6]、抗病毒、抗凝血[7]等作用,因而金耳在食品及藥品方面有很好的開發(fā)前景及應(yīng)用價值。目前已經(jīng)開發(fā)出的功能性金耳食品有金耳功能性酸奶、金耳玫瑰保健飲料等,都有一定的保健營養(yǎng)作用[8-9],已經(jīng)研究出的金耳糖肽膠囊藥品,已用在臨床上治療腦血管疾病[10]。雖然目前國內(nèi)外對于金耳的營養(yǎng)價值及藥用價值都進(jìn)行了大量的研究,但是金耳功能的研究主要集中在多糖方面[11-12],金耳脂類成分是否具有一些藥用功能,還未見有報道。

血腦屏障是中樞神經(jīng)系統(tǒng)特有的結(jié)構(gòu),一方面允許血液循環(huán)中腦組織所需營養(yǎng)物質(zhì)的通過,另一方面能阻擋有害物質(zhì)的侵入。但是由于血腦屏障的存在,使藥物很難到達(dá)病灶發(fā)揮作用,因而血腦屏障的存在使中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療成為難點[13-14]。目前研究發(fā)現(xiàn)一般脂溶性高、分子量小的物質(zhì)容易通過血腦屏障[15]。而大多數(shù)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物為水溶性的,正常情況下入腦量甚微。因而尋找脂溶性高、副作用小且能促進(jìn)治療藥物通過血腦屏障的物質(zhì),目前在國內(nèi)外日益受到關(guān)注[16]。在現(xiàn)代研究中,發(fā)現(xiàn)不少中藥或其單體自身能迅速通過血腦屏障發(fā)揮治療腦內(nèi)疾病的作用,如冰片、麝香、天麻、薄荷等中藥材都有開放血腦屏障的功能[17-19]。而冰片促進(jìn)藥物透過血腦屏障的作用尤為明顯[20-22]。因此本文選擇冰片與金耳脂類粗提物進(jìn)行透過血腦屏障的對比研究。

血腦屏障通透性的檢測方法有示蹤劑法、影像學(xué)法、透射電鏡法等。示蹤法可以對一些具有特殊物理化學(xué)特性的物質(zhì)通過血腦屏障進(jìn)行特殊描述。伊文氏藍(lán)是一種經(jīng)典的血腦屏障示蹤劑,入血后,幾乎百分之百地立即與血漿白蛋白結(jié)合,形成伊文氏藍(lán)-白蛋白復(fù)合物(ESA),并持續(xù)數(shù)小時存在于血液中,而且伊文氏藍(lán)在632nm處有最大吸收光譜,根據(jù)此特點可以利用分光光度計進(jìn)行血腦屏障的定性定量檢測[23]。因此本研究選用甲酰胺-紫外分光光度計檢測腦組織中的伊文氏藍(lán)含量,作為判斷血腦屏障開放程度的一種定量指標(biāo)。

綜上,本文將金耳提取得到的金耳脂類粗取物,進(jìn)行促進(jìn)伊文氏藍(lán)透過血腦屏障的研究和冰片進(jìn)行透過血腦屏障的對比研究,旨在研究金耳脂類作為載體可攜帶藥物通過血腦屏障發(fā)揮治療作用,為今后金耳脂類的功能開發(fā),以及將金耳制備成功能食品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金耳(Tremellaaurantialba) 取自中條山腹地;伊文氏藍(lán)(SCRC) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲酰胺 天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站;吐溫80 天津市化學(xué)試劑三廠;石蠟油 廣州市德隆化工貿(mào)易有限公司;冰片 河南萬博化工產(chǎn)品有限公司;其余試劑 均為分析純及常用試劑;昆明種雄性健康小鼠156只(20±2 g) 許可證號:SCXK(晉)2015-0001,山西醫(yī)科大學(xué)提供。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;JA1003型電子天平 上海良平有限公司;DHG-9240 A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;SP-2000UV型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;TGL-16G高速臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠制造;細(xì)胞組織勻漿器 北京博奧森技術(shù)有限公司;CTX-50型浴式超聲儀 北京醫(yī)療設(shè)備二廠;渦懸振蕩器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 金耳脂類粗取物的制備 將金耳置于烘箱65 ℃干燥24 h,粉碎過60目篩,取粉末適量,以10倍量的石油醚為提取溶劑,用連續(xù)回流法提取兩次,第一次4 h,第二次2 h,合并兩次提取液減壓濃縮,得到金耳脂類粗取物[24]。

1.2.2 金耳脂類粗取物與伊文氏藍(lán)混合物的制備 1%的伊文氏藍(lán)液的配制:稱取伊文氏藍(lán)適量,以生理鹽水為溶劑,配制成伊文氏藍(lán)液含量1%的溶液;

5%的金耳脂類粗取物的配制:稱取金耳脂類粗取物,取等量的吐溫80做乳化劑,再用生理鹽水配制成金耳脂類粗取物含量5%的溶液,最后超聲使之分散成均勻的乳劑;

5%金耳脂類粗取物伊文氏藍(lán)混合液的配制:稱取所需的金耳脂類粗取物量,取等量的吐溫80做乳化劑,再加入稱好的伊文氏藍(lán),最后用生理鹽水逐漸稀釋至伊文氏藍(lán)含量為1%、金耳脂類粗取物含量為5%的混合液,最后超聲使之分散成均勻的乳劑;

5%的冰片石蠟油的配制:以液體石蠟為溶劑配制成所需濃度。

1.2.3 伊文氏藍(lán)含量測定方法的建立 采用甲酰胺提取-紫外分光光度法[25]。稱取4 mg伊文氏藍(lán)于容量瓶中,加生理鹽水至總?cè)莘e為25 mL,取0.3 mL加入5.7 mL甲酰胺中混勻作為第1管;從第1管中取3 mL加入3 mL甲酰胺中作為第2管;將第2管溶液對半稀釋作為第3管;依此類推共作6管,其濃度依次為8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL。于37 ℃水浴震蕩提取72 h后,在632 nm處測定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 給藥方式對其促透作用的影響

1.2.4.1 分開給藥與混合給藥的影響 取昆明種小鼠24只,體重20±2 g,隨機(jī)分為3組,每組各8只,3組分別為對照組、分開給藥組、混合給藥組。小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼喂2 d后,空腹12 h后用藥,對照組注射1%的伊文氏藍(lán)液0.1 mL/10 g;分開給藥組尾靜脈注射1%伊文氏藍(lán)0.1 mL/10 g,腹腔注射5%的金耳脂類粗取物液0.1 mL/10 g;混合給藥組尾靜脈注射5%金耳脂類粗取物伊文氏藍(lán)混合液0.1 mL/10 g[26]。

各組分別于注射后的2、4 h取腦,并用生理鹽水清洗殘留的血液然后勻漿,取腦右半球組織勻漿,按2 mL/100 mg加甲酰胺,然后于37 ℃恒溫水浴振搖72 h,3000 r/min離心15 min,取上清液在632 nm處測定其吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算腦組織中伊文氏藍(lán)濃度[25]。

1.2.4.2 灌胃與注射給藥的影響 取24只小鼠隨機(jī)分為3組,每組各8只,即對照組(Ⅰ)、灌胃組(Ⅱ)、注射組(Ⅲ)。小鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后于同一時間用藥,其中Ⅰ組注射1%伊文氏藍(lán)液0.1 mL/10 g,Ⅱ組灌胃5%金耳脂類粗取物伊文氏藍(lán)混合液0.1 mL/10 g、Ⅲ組注射金5%耳脂類粗取物伊文氏藍(lán)混合液0.1 mL/10 g[22],其余方法同1.2.4.1。

1.2.5 給藥量對其促透作用的影響 取60只小鼠隨機(jī)分為3組,每組各20只,即對照組(Ⅰ)、金耳脂類粗取物低劑量組(Ⅱ)、金耳脂類粗取物高劑量組(Ⅲ),小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼喂2 d后,并于同一時間分別尾靜脈注射溶液,Ⅰ組注射1%伊文氏藍(lán)液0.1 mL/10 g,Ⅱ組注射5%金耳脂類粗取物伊文氏藍(lán)混合液0.1 mL/10 g、Ⅲ組注射金耳脂類粗取物5%伊文氏藍(lán)混合液0.15 mL/10 g[22]。

各組分別于注射后的0.25、0.5、1、2、4 h取腦及肝、脾,并用生理鹽水清洗殘留的血液然后勻漿,取腦右半球勻漿,其中腦和肝按2 mL/100 mg加甲酰胺,脾按4 mL/100 mg加甲酰胺,其余方法同1.2.4.1。

1.2.6 金耳脂類粗取物與冰片促進(jìn)伊文氏藍(lán)的對比研究 取48只小鼠隨機(jī)分為3組,每組各16只,即對照組(Ⅰ)、金耳脂類粗取物組(Ⅱ)、冰片組(Ⅲ),小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼喂2 d后于同一時間分別尾靜脈注射溶液,Ⅰ組注射1%伊文氏藍(lán)液0.1 mL/10 g,Ⅱ組注射5%金耳脂類粗取物伊文氏藍(lán)混合物0.1 mL/10 g、Ⅲ組灌胃冰片石蠟油液0.1 mL/10 g,隨后尾靜脈注射伊文氏藍(lán)液0.1 mL/10 g[27]。

各組分別于注射后的0.5、1、2、4 h取腦,并用生理鹽水清洗殘留的血液然后勻漿,取腦右半球勻漿,按2 mL/100 mg加甲酰胺,其余方法同1.2.4.1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics對研究結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量數(shù)值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用ANOVA分析,檢測不同組與對照組之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 伊文氏藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由圖1可知,各組織中伊文氏藍(lán)的濃度在0～8.0 mg/L時,提取液的吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系,y=0.0522x-0.0151,R2=0.9988,說明用甲酰胺提取-紫外分光光度法測定小鼠各臟器中伊文氏藍(lán)的濃度,重現(xiàn)性好,能有效地減少臟器中殘留血跡含有的非測定性成分產(chǎn)生的熒光對測定的干擾。

圖1 伊文氏藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Evans Blue standard curve

2.2 分開給藥與混合給藥對透過腦組織的伊文氏藍(lán)濃度影響

由表1結(jié)果可以看出,與對照組相比,混合給藥組在給藥后2、4 h均有顯著性差異(P<0.05),而分開給藥組僅在4 h時有顯著差異(P<0.05)。兩組腦組織勻漿中伊文氏藍(lán)的濃度明顯高于對照組,在用藥2 h時,混合給藥組腦組織內(nèi)伊文氏藍(lán)的濃度達(dá)到13.25 μg/g,遠(yuǎn)高于對照組伊文氏藍(lán)的濃度4.20 μg/g,同時結(jié)果顯示混合給藥法相比較分開給藥法,具有能在短時間內(nèi)達(dá)到較高濃度、代謝期較長的優(yōu)點。因而表明此類金耳脂類粗取物具有促進(jìn)伊文氏藍(lán)透過血腦屏障進(jìn)入腦組織的作用,且給藥方式以混合給藥法效果較好。

表1 分開給藥與混合給藥對金耳脂類粗取物促透作用的影響Table 1 Effect of separate and mixed administration on thepermeability of fatty extracts from Tremella auricula

注:與同一時間對照組相比,*表示P<0.05,具有顯著性差異,**表示P<0.01,具有極顯著差異;表2～表6同。

2.3 灌胃與注射對透過腦組織的伊文氏藍(lán)濃度影響

表2結(jié)果可以看出,與對照組相比,注射組靜脈注射2 h腦液中伊文氏藍(lán)濃度具有極顯著差異(P<0.01),平均值為15.96 μg/g,而灌胃組沒有顯著差異;給藥4 h時,灌胃組具有顯著性差異(P<0.05),而注射組則具有極顯著性區(qū)別(P<0.01),同時注射組濃度比灌胃組濃度高。因此采用注射方式較好。此外對照組、注射組、灌胃組3組在用藥4 h時伊文氏藍(lán)的濃度均比2 h時低,表明在2～4 h時小鼠已經(jīng)開始代謝,因此研究用藥時間應(yīng)控制在0～4 h。

表2 不同給藥方式對小鼠腦中伊文氏藍(lán)濃度的影響Table 2 Effects of different administration wayson the concentration of Evans Blue in the brain of mice

2.4 給藥劑量及純度對金耳脂類粗取物促進(jìn)伊文氏藍(lán)透過各個器官的影響

2.4.1 腦組織中伊文氏藍(lán)濃度的比較結(jié)果 表3結(jié)果顯示,低劑量組、高劑量組在用藥后0.25～2 h間,大腦中伊文氏藍(lán)含量均有不同程度的增加,而且隨著時間增長而增加。表明伊文氏藍(lán)金耳脂類粗取物進(jìn)入血腦屏障需要一定的時間,因此腦組織中伊文氏藍(lán)的濃度在0～2 h有增加的趨勢,呈時間效應(yīng)。結(jié)果顯示,總體腦中伊文氏藍(lán)濃度由大到小順序為:高劑量組>低劑量組>對照組,其中,高劑量組在每個時間段含量都最高。與對照組相比,高劑量組在1、2、4 h這幾個時間段均有極顯著差異(P<0.01),0.5 h時具有顯著差異(P<0.05);低劑量組在2、4 h具有極顯著差異(P<0.01),1 h時具有顯著差異(P<0.05)。因此實驗結(jié)果表明:金耳脂類粗取物可促進(jìn)伊文氏藍(lán)透過血腦屏障,且高劑量時效果較好。

表3 腦組織中伊文氏藍(lán)的濃度Table 3 Concentrations of Evans Blue in Brain Tissues

2.4.2 肝組織中伊文氏藍(lán)濃度的比較結(jié)果 表4結(jié)果顯示,與對照組相比,在肝組織中,高劑量組在0.5、1、2、4 h這幾個時間段均有極顯著差異(P<0.01);低劑量組在1、2、4 h具有極顯著差異(P<0.01),0.5 h時具有顯著差異(P<0.05)。由于伊文氏藍(lán)經(jīng)靜脈注入后,就會迅速遍布體內(nèi),聚集在肝、脾等器官,唯獨不能進(jìn)入腦組織。由表4數(shù)據(jù)可以看出,對照組肝組織中的伊文氏藍(lán)含量在1 h時含量達(dá)到最高,而且與2 h相比差別不大,而低劑量組、高劑量組都在2 h時含量急劇下降,尤其高劑量組下降較快。結(jié)合腦組織中伊文氏藍(lán)含量數(shù)值,可以得出攜帶伊文氏藍(lán)的金耳脂類粗取物混合物,其金耳脂類粗取物含量越高,結(jié)合伊文氏藍(lán)量越大,透過血腦屏障的濃度越大,提高了有效濃度,降低了伊文氏藍(lán)與血漿白蛋白結(jié)合,因而在肝內(nèi)的濃度降低。

表4 肝組織中伊文氏藍(lán)的濃度Table 4 Concentrations of Evans Blue in Liver Tissues

2.4.3 脾組織中伊文氏藍(lán)濃度結(jié)果比較結(jié)果 表4結(jié)果顯示,與對照組相比,在脾組織中,低劑量組、高劑量組在0.25、0.5、1、2、4 h這幾個時間段均有極顯著差異(P<0.01)。各組在0.25 h時,所測結(jié)果均較低,而在1 h時,低劑量組、高劑量組脾組織含量都達(dá)到最高,而對照組1 h時濃度最大。由于伊文氏藍(lán)入血后,幾乎百分之百地立即與血漿白蛋白結(jié)合,形成伊文氏藍(lán)-白蛋白復(fù)合物,并持續(xù)數(shù)小時存在于血液中,所以對照組在每個時間段檢測值都較大;而將金耳脂類粗取物與伊文氏藍(lán)混合注射,由于一部分伊文氏藍(lán)結(jié)合金耳脂類粗取物透過血腦屏障,因而在1 h后各個實驗組脾中伊文氏藍(lán)含量均降低,尤其高劑量組脾中伊文氏藍(lán)含量最低。

表5 脾組織中伊文氏藍(lán)的濃度Table 5 Concentrations of Evans Blue in Spleen Tissues

2.4.4 腦、肝、脾中伊文氏藍(lán)濃度比較結(jié)果 圖2～圖4結(jié)果顯示,與低劑量組、高劑量組相比,對照組小鼠脾中伊文氏藍(lán)含量呈增長趨勢,且伊文氏藍(lán)在腦組織內(nèi)的含量4 h內(nèi)變化不太明顯;低劑量組、高劑量組曲線變化趨勢大致相同,其中肝、脾組織中伊文氏藍(lán)含量,基本在1 h前呈上升趨勢,1 h后呈下降趨勢,而腦組織中伊文氏藍(lán)含量則是在2 h時達(dá)到最高,其后含量開始降低。結(jié)果表明相比較對照組,低劑量組、高劑量組在注射金耳脂類粗取物伊文氏藍(lán)混合物2 h時,藥物透過血腦屏障聚集在腦組織內(nèi)的濃度最大,此時肝、脾中游離的伊文氏藍(lán)相對較少,表明金耳脂類粗取物結(jié)合伊文氏藍(lán)具有促進(jìn)伊文氏藍(lán)透過血腦屏障進(jìn)入腦組織作用。

圖2 對照組3種器官中伊文氏藍(lán)濃度比較曲線圖Fig.2 Comparisons of Evans Blue concentrationin three organs of the control group

表6 腦組織中伊文氏藍(lán)濃度Table 6 Evans Blue concentration in brain tissue

圖3 低劑量組3種器官中伊文氏藍(lán)濃度比較曲線圖Fig.3 Comparisons of Evans Blue Concentrationin Three Organs of Low Dose Group

圖4 高劑量組3種器官中伊文氏藍(lán)濃度比較曲線圖Fig.4 Comparisons of Evans Blue concentrationin three organs of high dose group

2.5 冰片與金耳脂類粗取物促進(jìn)伊文氏藍(lán)透過血腦屏障的對比結(jié)果

實驗所得結(jié)果表6表明,對照組與金耳脂類粗取物組在用藥后0.5～2 h間,大腦中伊文氏藍(lán)含量呈增加趨勢,但是在4 h時含量降低。而冰片組在1 h時伊文氏藍(lán)濃度最大,且冰片組與對照組相比在用藥2 h時具有極顯著差異(P<0.01),在用藥0.5 h與2 h時具有顯著差異(P<0.05);金耳脂類粗取物組則是在用藥2 h時達(dá)到濃度最大19.31 μg/g,且均大于對照組及冰片組。因此,實驗結(jié)果表明:冰片在1 h時到達(dá)腦內(nèi)濃度最大,金耳脂類粗取物組在2 h時到達(dá)腦內(nèi)伊文氏藍(lán)濃度最大,且高于冰片組最大濃度18.88 μg/g,表明金耳脂類粗取物組雖然作用時間較冰片組長,但是透過血腦屏障的效果較冰片好。冰片具有芳香開竅作用,可以暫時開放血腦屏障,因而冰片可以短時間內(nèi)促進(jìn)伊文氏藍(lán)透過血腦屏障,但是金耳脂類粗取物可以更為持久的促進(jìn)伊文氏藍(lán)透過血腦屏障,而且增加了伊文氏藍(lán)在腦內(nèi)的停留時間。

3 結(jié)論

經(jīng)研究結(jié)果表明金耳脂類粗取物可以促進(jìn)伊文氏藍(lán)透過血腦屏障,并且得出選用混合給藥方式比分開給藥效果好、尾靜脈注射比灌胃效果好、尾靜脈注射2 h時效果最好、高劑量的金耳脂類粗取物促進(jìn)伊文氏藍(lán)透過血腦屏障效果好、在用藥2 h時金耳脂類粗取物較冰片促進(jìn)伊文氏藍(lán)透過血腦屏障效果要好。此研究結(jié)果對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療研究有一定的意義,因此可以進(jìn)一步研究金耳作為載體促進(jìn)臨床用藥透過血腦屏障發(fā)揮作用,也可開發(fā)制備功能食品,具有很好的市場應(yīng)用前景。但是目前尚不清楚發(fā)揮作用的金耳脂類成分是什么,因此有待于進(jìn)一步進(jìn)行金耳脂類物質(zhì)的提取分離純化,以明確發(fā)揮作用的成分。