諸瓊妞,2,祝超智,*,趙改名,張秋會,崔文明

(1.河南農業(yè)大學食品科學技術學院,河南鄭州 450002;2.南京農業(yè)大學食品科學技術學院,江蘇南京 210095)

豬肉湯僅滋味甚好,且溶于水中的營養(yǎng)成分較多,含有豐富的短肽、氨基酸、脂肪酸、骨膠類物質以及礦物質元素等,易被人體吸收和利用[1]。根據湯的色澤可分為白湯、清湯和素湯[2]。白湯經加工后,色澤乳白,煮制過程中不添加食鹽[2]。清湯湯汁澄清,以豬肉、豬骨等為原料煮制而成,加入食鹽等調味料,煮制的湯就變成了透明的清湯,口味鮮濃[3]。加入食鹽后,肉湯中原來的乳化體系被打破,煮制的白湯變成了清湯。

在食品加工過程中添加一定濃度鹽是必須的[4]。在肉湯煮制過程中添加食鹽,鈉離子可提供咸味,氯離子促使肌原纖維蛋白溶解并對咸味起到修飾,從而發(fā)揮其加工特性[5]。肉中的蛋白質不能直接被人體內利用,而是轉變?yōu)榘被嵝》肿雍蟊晃?。通過燉或煮的方法,將肉蛋白水解為易被利用的氨基酸而更有利于人體的吸收。煮制過程中食鹽的添加,會改變肌原纖維蛋白的結構,尤其是肌球蛋白的提取率、完整性[6],進而影響蛋白質的功能特性及降解途徑。另外,不飽和脂肪酸尤其是多不飽和脂肪酸對熱不穩(wěn)定,加鹽與無鹽肉湯都需經過高溫煮制,這對于不飽和脂肪酸有一定的破壞作用,而食鹽能在一定程度上防止氧化,提高肉湯的保水保油性能和貨架期等[7],影響了食用品質。

隨著人們對加工類肉制品需求量的不斷增加及對肉制品營養(yǎng)品質要求的不斷提高,對加工過程中食品成分的相互作用以及對產品品質、營養(yǎng)特性影響的研究越來越迫切。本文研究食鹽對肉湯煮制過程中蛋白質及其降解物、脂肪及脂肪酸含量的差異變化。不僅明確了造成肉湯差異化的主要原因,也為食鹽對肉制品營養(yǎng)及風味的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷鮮豬肉(帶皮里脊) 產于開封市福生祥食業(yè)有限公司,購于鄭州市花園路拜特超市;食鹽(食用級) 鄭州市文化路丹尼斯超市;BCA法測定蛋白濃度試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司;預染彩虹廣譜蛋白Marker(ColorMixed Protein Marker range 11-245 KD) 北京索萊寶科技有限公司;AccQ·Tag氨基酸試劑包 美國Waters公司;37種脂肪酸甲酯混標 美國Supelco公司;無水乙醚、三氯乙酸、氯仿等均為國產分析純,正己烷(色譜純) 國藥集團化學試劑有限公司;氮氣 河南迎眾化工產品有限公司。

T10 ULTRA-TURRAX高速分散器 德國IKA;MULTISKAN GO酶標儀 上海賽默生物科技發(fā)展有限公司;24 DN制膠器 北京市六一儀器廠;DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠;Upland,CA凝膠成像系統 美國UVP公司;ALLEGRA-64A高速冷凍離心機 鄭州美生商貿有限公司;ZF-06A脂肪測定儀 上海瑞正儀器設備有限公司;K1301半自動凱氏定氮儀 上海晟生有限公司;GC-2010氣相色譜儀(配有氫火焰檢測器(FID)及數據分析工作站) 日本島津公司;Waters2695高效液相色譜儀(配有二極管檢測器、717plus自動進樣器及數據分析工作站) 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬肉湯的制備 將帶皮里脊去除表皮、筋腱、淋巴、血管等,清水浸泡,去除血污,瀝干,把肥、瘦肉切分開,按照肥瘦比為3∶7分成兩份,保持水溫90 ℃以上焯5 min,撇去浮沫和臟污,撈出冷涼并分別將肥、瘦肉切割成2 cm×1 cm×1 cm的塊狀,以肉∶清水比1∶1.5,(w/w)的比例[8]煮制。加鹽組清水中加入水重2%的食鹽,無鹽組直接用清水煮制。兩組處理均先用不銹鋼鍋大火煮制15 min,條件為1600 W,210 ℃,隨后小火煮制2 h,條件為120 W,70 ℃。分別在小火煮制過程的30,60,90,120 min時取樣。制樣品時將肉湯用單層紗布過濾,無明顯大顆粒存留。

1.2.2 樣品中粗蛋白含量的測定 吸取樣品20 mL(精確到0.1 mL以下同)于離心管中,采用馮志明[9]的方法并略作修改,經過3500 r/min,4 ℃離心10 min后,參照BCA法蛋白質濃度測定。選取酶標板上40個孔,分為標準組和樣品組。其中16個孔,每個標準品設置1個重復,各孔分別加入20 μL相應濃度的標準蛋白質溶液;剩余24個孔,分為3個平行組,平行孔編號相同,其中編號不同的8個孔加入濃度不同的20 μL樣品稀釋液。再向各酶標孔加入200 μL BCA工作液,迅速混勻。在37 ℃水浴中保溫30 min,冷卻至室溫后,在酶標儀上測各孔的A562 nm值。以標準組各孔A562 nm平均值為縱坐標,對應的蛋白質濃度為橫坐標,繪制標準曲線。根據三個相同樣品稀釋液A562 nm值的平均值,在標準曲線上計算出該樣品經過稀釋后的蛋白質濃度,選擇合適稀釋度的樣品計算最終的樣品蛋白濃度,再由稀釋倍數計算原樣品粗蛋白濃度。

1.2.3 樣品中非蛋白總氮含量的測定 吸取樣品20 mL(精確到0.1 mL)于燒杯中,采用趙改名等[10]的方法,加入150 g/L三氯乙酸溶液(或15%)20 mL,漩渦混勻1 min以充分沉淀蛋白,于4 ℃冰箱里放置過夜,次日2500×g離心10 min后取濾液,移取10 mL濾液,參照微量凱氏定氮法測定非蛋白氮含量[11]。

1.2.4 樣品中可溶性蛋白氮含量的測定 吸取樣品20 mL(精確到0.1 mL)于燒杯中,采用趙改名等[10]的方法,加入70 mL緩沖液(50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液,pH6.0),在冰浴中高速勻漿1次(22000 r/min),在4 ℃冰箱里放置2 h,12000×g,4 ℃離心15 min,中速濾紙過濾后,用緩沖液定容至100 mL。按照測定粗蛋白含量方法,參照BCA法蛋白質濃度測定。

1.2.5 樣品中鹽溶性蛋白含量的測定 吸取樣品10 mL(精確到0.1 mL)于燒杯中,采用劉野[12]的方法并略作修改,加入80 mL NaCl(0.8 mol/L)溶液,10 mL MgCl2(0.04 mol/L)溶液,用Na2HPO4和NaH2PO4(4 g/kg)粉末,用玻璃棒攪拌10 min,調整pH為7,用高速分散器最低轉速下勻漿3 min后,上清液用四層紗布過濾,所得濾液即為肉湯鹽溶性蛋白粗提液,參照BCA法蛋白質濃度測定。

1.2.6 樣品蛋白質相對分子質量的測定 以分子量范圍為11～245 kDa,采用SDS-PAGE分析食鹽的添加對煮制過程中肉湯成分的全蛋白的降解情況,參照黃體冉等[13]的方法并略作修改,制膠的分離膠濃度為15%(4.6 mL水,10 mL 30%丙烯酰胺溶液,5 mL 1.5 mol/L Tris(pH8.8),0.2 mL 10% SDS,0.2 mL 10%過硫酸銨,8 μL 0.05% TEMED),濃縮膠濃度為5%(6.8 mL水,1.66 mL 30%丙烯酰胺溶液,1.26 mL 1.5 mol/L Tris(pH6.8),0.1 mL 10% SDS,0.1 mL 10%過硫酸銨,10 μL 0.05% TEMED)。先將10 mL樣品離心取上層清液,按30 μL上清液加入10 μL 上樣緩沖液的比例混勻后,100 ℃水浴加熱10 min,使蛋白變性。冷卻至室溫后,離心12000 r/min,5 min,取上清液10 μL直接上樣電泳。樣品進入凝膠以后,在濃縮膠時,將電壓調至80 V,保持電壓強度不變,在分離膠時,再將電壓調至120 V,保持電壓強度不變。電泳結束后,準備好染色用的培養(yǎng)皿,用水緩慢將凝膠從玻璃板上脫離。在培養(yǎng)皿內加入考馬斯亮藍R-250染色液,充分混勻,浸泡4 h以上。染色完畢,傾出染色液,用蒸餾水沖洗后將凝膠置于脫色液中,脫色4～8 h,其間更換脫色液2～3次。

注:同一列不同大寫字母表示同一加鹽量不同煮制時間下豬肉湯各指標的差異顯著(P<0.05);同列不同小寫字母表示加鹽與無鹽豬肉湯各指標的差異顯著(P<0.05);表2～表5、圖2、圖4 同。

1.2.7 樣品中氨基酸含量及成分的測定 利用高效液相色譜儀,柱前衍生進行氨基酸分析測定。參照顧偉鋼[14]和高向陽[15]的方法并略作修改,精確吸取樣品5 mL(精確到0.1 mL),與鹽酸按體積比1∶1加入水解管中,110 ℃水解24 h,冷卻后,超純水洗滌三次,用氫氧化鈉溶液調pH至9.0左右,用超純水定容至50 mL容量瓶中。色譜條件:色譜柱:Ultimate Amino acid,4.6 mm×250 mm,5 μm,;流動相A:V(醋酸鈉溶液)∶V(乙腈)=93∶7,流動相B:V(水)∶V(乙腈)=20∶80,其中醋酸鈉溶液用冰醋酸調節(jié)pH6.5(流動相A配好的醋酸鈉需先調節(jié)pH到6.5,再按照上述比例加入乙腈進行抽濾),流動相梯度洗脫;柱溫:37 ℃;流速:1 mL/min;檢測波長:254 nm;進樣量:5 μL。

1.2.8 樣品中脂肪含量的測定 吸取樣品20 mL(精確到0.1 mL),置于鋁盒中,加入海砂約10 g,攪勻后先在95～105 ℃的烘箱中烘6 h直至恒重[16]。參照GB 5009.6-2016食品中脂肪的測定,以無水乙醚為萃取劑采用索氏提取器進行抽提[17]。

1.2.9 樣品中脂肪酸含量及成分的測定 吸取樣品5 mL(精確到0.1 mL)于50 mL離心管中,參照瞿明勇[1]的方法,用氮吹至出現黃白色固體。再用正己烷進行甲酯化。取上清液進行GC分析。色譜柱:DB-WAX(60 m×0.53 mm×1 μm);分流進樣,分流比為1;載氣控制方式:線速率36 cm/sec;SPL:250 ℃;FID:280;柱箱溫度:50.0 ℃為初始溫度,保留1.00 min;25.00 ℃/min升至200.0 ℃不保留;3.00 ℃/min升至230.0 ℃保留50.00 min。

1.2.10 樣品蛋白水解指數(PI)計算 公式如下[18]。

式中:A為樣品總氮含量;B為樣品非蛋白氮含量。

1.3 數據處理

每組試驗重復三次,試驗數據均以平均值±標準差表示,以平均值±標準差表示測定結果,采用Excel 2007和SPSS 13.0軟件進行數據分析。采用ANOVA對實驗數據進行差異分析,P<0.05為顯著。

2 結果與分析

2.1 加鹽與無鹽豬肉湯煮制過程中蛋白含量的變化

由表1可知,食鹽的添加使豬肉湯中粗蛋白、非蛋白總氮、可溶性蛋白、鹽溶性蛋白和蛋白質水解指數均顯著增加(P<0.05)。加鹽肉湯煮制過程中,粗蛋白與可溶性蛋白氮含量持續(xù)上升,且在煮制90 min時,其含量與無鹽肉湯的差值最大。在煮制60～90 min期間,無鹽肉湯中蛋白質降解反應最劇烈,90 min后水解指數趨于穩(wěn)定,其蛋白質水解程度始終弱于加鹽肉湯。非蛋白氮是表征蛋白質降解的一個指標[19],煮制時間對無鹽肉湯中非蛋白總氮含量有顯著性影響(P<0.05)。加鹽肉湯的鹽溶性蛋白含量高于無鹽肉湯,肌肉蛋白在鹽溶液中溶解是一個重要的物化過程,肉中的大部分蛋白質為水不溶性蛋白質[20],隨著肉湯中食鹽濃度增加,且每煮制30 min,鹽溶性蛋白含量約增加0.6 mg/mL,隨著肉湯中食鹽濃度增加,蛋白質溶解到水相中,浸提出大量鹽溶性蛋白質,從而肌原纖維吸水膨脹[21],與肉制品的加工特性如凝膠性、保水性等有密切關系,直接影響最終產品的食用品質[22]。

2.2 加鹽與無鹽豬肉湯煮制過程中脂肪含量的變化

由表2可知,煮制時間對肉湯中粗脂肪含量有顯著性影響(P<0.05),長時間的煮制有利于脂肪從肌肉中析出。食鹽的添加使肉湯的脂肪含量顯著增加(P<0.05),煮制30 min時加鹽與無鹽肉湯的脂肪含量差值較小,到煮制120 min時,加鹽肉湯脂肪含量比無鹽肉湯多了3.193 mg/mL,差值增加了5倍。且加鹽肉湯在煮制90 min時的脂肪含量就達到了無鹽肉湯煮制120 min時的脂肪含量。

表2 加鹽與無鹽豬肉湯煮制過程中的脂肪含量Tab1e 2 Fat contents in pork broth withor without salt at different cooking times

2.3 SDS-PAGE凝膠電泳

SDS-PAGE凝膠電泳圖譜顯示煮制過程中大分子蛋白降解明顯。由圖1可知,無鹽肉湯中分子量主要集中在135～245 kDa;而加鹽肉湯中分子量主要集中在35～48 kDa,還含有17～25 kDa的低分子蛋白條帶。加鹽肉湯中低分子量蛋白條帶更多,這說明食鹽的添加使大分子蛋白降解成小分子蛋白。并且隨著煮制時間的增加,蛋白條帶變多且顏色加深,說明蛋白水解更徹底。

圖1 不同煮制時間下加鹽與無鹽豬肉湯中全蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.1 SDS-PAGE profile of whole proteinin pork broth with or without salt at different cooking times

2.4 加鹽與無鹽豬肉湯中水解氨基酸含量及組成的變化

由表3可知,在煮制過程中,食鹽的添加使肉湯中水解氨基酸總含量顯著增加(P<0.05),與前面對肉湯中粗蛋白含量的測定結果趨勢一致。由圖2可知,在煮制120 min時,食鹽的添加對肉湯中Glu、Gly、His、Arg、Pro、Tyr、Leu含量有顯著性影響(P<0.05)。加鹽肉湯的Glu、Gly、His、Tyr等含量顯著高于無鹽肉湯,特別是加鹽肉湯的His含量較高,其對于嬰幼兒的成長尤為重要。食品中營養(yǎng)價值的高低主要由蛋白質中氨基酸的含量、組成及比例決定[23],在煮制過程中,各種氨基酸成分含量呈上升趨勢,且加鹽肉湯的必需氨基酸及總量均高于無鹽肉湯,故加鹽肉湯的營養(yǎng)成分能更好地被人體吸收利用。

表3 加鹽與無鹽豬肉湯煮制過程中的水解氨基酸總含量Table 3 Contents of hydrolyzed amino acids in pork brothwith or without salt at different cooking times

圖2 煮制120 min時豬肉湯中的水解氨基酸含量及成分Fig.2 Contents and composition of hydrolyzedamino acids in pork broth for 120 minutes

2.5 加鹽與無鹽豬肉湯中游離氨基酸含量及組成的變化

氨基酸多以結合形式存在于蛋白質中,以自由態(tài)存在的游離氨基酸是由氨肽酶對肽類的分解而產生的[24],其可以通過和脂類發(fā)生的氧化反應,促進滋味產生,形成風味物質[25],一般把谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸這6種能呈現出特殊鮮味的氨基酸稱為呈味氨基酸[26]。由表4可知,在煮制90 min后,加鹽肉湯中游離氨基酸總含量顯著高于無鹽肉湯(P<0.05),說明隨著加熱的進行,食鹽可以促進游離氨基酸的溶出。由圖3可知,在煮制120 min時,食鹽的添加對肉湯中Gly、Arg、Thr、Ala、Pro、Tyr、Phe含量有顯著性影響(P<0.05)。Arg在肉湯體系中的含量最多且增加量最大,無鹽肉湯的Gly、Thr、Ala、Pro等含量均高于加鹽肉湯,故無鹽肉湯的必需氨基酸和呈味氨基酸均高于加鹽肉湯。

表4 加鹽與無鹽豬肉湯煮制過程中的游離氨基酸總含量Table 4 Contents of free amino acids in pork brothwith or without salt at different cooking times

圖3 煮制120 min時豬肉湯中的游離氨基酸含量及成分Fig.3 Content and composition offree amino acids in pork broth for 120 minutes

2.6 加鹽與無鹽豬肉湯中主要脂肪酸含量及組成的變化

脂肪酸含量的變化較為復雜,磷脂或甘油酯水解可以提高脂肪酸含量,但同時脂肪酸(尤其是不飽和脂肪酸)發(fā)生氧化,會使脂肪酸含量降低[27]。由表5可知,食鹽的添加使肉湯中脂肪酸總含量顯著增加(P<0.05),與前面肉湯中脂肪含量的測定結果趨勢一致。由圖4可知,在煮制120 min時,食鹽的添加對肉湯中C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1含量均有顯著性影響(P<0.05)。加鹽肉湯中的C18∶1含量顯著高于無鹽肉湯,C18∶1作為主要單不飽和脂肪酸的一種,故加鹽肉湯的單不飽和脂肪酸含量顯著高于無鹽肉湯;無鹽肉湯的C18∶0顯著高于加鹽肉湯,C18∶0作為主要飽和脂肪酸的一種,故無鹽肉湯中飽和脂肪酸含量高于加鹽肉湯,這可能跟加熱過程中無鹽肉湯中不飽和脂肪酸氧化成飽和脂肪酸有關[1],說明食鹽的添加在一定程度上防止不飽和脂肪酸的氧化。煮制120 min時,加鹽肉湯中脂肪酸含量主要由單不飽和脂肪酸組成,達到52.98%;其次是飽和脂肪酸,占44.71%;多不飽和脂肪酸的含量最低,為2.30%。油酸占單不飽和脂肪酸中比例最高;而多不飽和脂肪酸中亞油酸較高。這與王蒙[28]等對清燉豬肉湯香氣物質分析結果中一致。

表5 加鹽與無鹽豬肉湯煮制過程中的脂肪酸總含量Table 5 Contents of fatty acids in pork brothwith or without salt at different cooking times

圖4 煮制120 min時豬肉湯中的脂肪酸含量及成分Fig.4 Content and composition offatty acids in pork broth for 120 minutes

3 結論

本實驗對加鹽與無鹽豬肉湯煮制過程中的蛋白質、脂肪等進行了定性與定量分析,驗證了食鹽添加對肉湯成分的影響,不僅為肉湯營養(yǎng)及風味提供參考,更明確了造成肉湯差異化的主要原因。在不同煮制時間下,加鹽肉湯中粗蛋白含量、可溶性蛋白含量、非蛋白氮含量、鹽溶性蛋白含量、脂肪含量、氨基酸總含量、脂肪酸總含量均高于無鹽肉湯。SDS-PAGE凝膠電泳圖譜顯示,食鹽的添加使大分子蛋白降解成小分子蛋白。無鹽肉湯游離氨基酸中的呈味氨基酸和脂肪酸中的飽和脂肪酸含量均高于加鹽肉湯,故其滋味比加鹽肉湯要鮮美;加鹽肉湯中的氨基酸總含量、脂肪及脂肪酸總含量均高于無鹽肉湯,且其必需氨基酸比例更高,單不飽和脂肪酸更豐富,更有利于被人體吸收利用,在一定程度上提高了營養(yǎng)品質。