王 巧, 周艷平, 鄭惠成, 彭金彬, 方福鐘, 鄒雙全

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.莆田市荔城區(qū)西天尾鎮(zhèn)林業(yè)站，福建 莆田 351131；3.福建省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，福建 福州 350003；4.泉州市洛江區(qū)林業(yè)局，福建 泉州 362011；5.漳州市林業(yè)科學(xué)研究所，福建 漳州 363000)

牛樟(CinnamomumkanehiraeHayata)屬樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)植物，又名黑樟，原產(chǎn)地為我國臺灣[1]。牛樟主要分布于海拔200～2 000 m的山區(qū)，尤其以臺灣的新竹、花東及中南部較多[2]。老齡腐朽的牛樟樹干內(nèi)壁寄生了極具藥用價值的牛樟芝，因而深受醫(yī)療保健市場的歡迎[3]。由于過度砍伐，目前牛樟天然林僅存在于交通不便的中、高海拔地區(qū)，且多為單株分散的高齡老樹，結(jié)實(shí)量少，樹高體大不容易攀爬，母樹間授粉不易，采種也極其困難[4]?，F(xiàn)有的大量民間引種未經(jīng)系統(tǒng)鑒別，導(dǎo)致種源混亂，阻礙了牛樟的良種保存與繁育。為加強(qiáng)牛樟種質(zhì)資源的保護(hù)與滿足市場需求，需建立有效的鑒別技術(shù)。

分子標(biāo)記技術(shù)已在作物遺傳多樣性分析、品種鑒定及遺傳圖譜構(gòu)建等方面得到廣泛應(yīng)用。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)具有遺傳信息豐富、可檢測的多態(tài)性強(qiáng)、DNA純度要求不高、條帶清晰等特點(diǎn)[5]，已廣泛應(yīng)用于水稻[6]、桃[7]及芹菜[5]等研究中。簡單重復(fù)序列區(qū)間(inter-simple sequence repeat, ISSR)具有遺傳信息豐富、可檢測的多態(tài)性強(qiáng)、試驗操作簡單并且成本較低等特點(diǎn)[8]。朱麗萍[8]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測牛樟、冇樟和樟樹三者的族群遺傳結(jié)構(gòu)表明，牛樟為臺灣的特有種，并認(rèn)為牛樟是由樟樹演變而來的。孟紅巖等[9]探索了臺灣牛樟總RNA的提取方法；Hung et al[10]在樟屬植物中分離出了15個微衛(wèi)星序列，可用于牛樟等樟屬植物的鑒定；曾煥中等[11]根據(jù)樟腦素、松油醇和黃樟素含量判別是否為牛樟。目前尚未見利用SRAP與ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究牛樟種質(zhì)。福建省為適宜牛樟生長的主要地區(qū)，為此本研究在福建選取10個牛樟種質(zhì)，通過SRAP與ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析種質(zhì)間的遺傳多樣性，以期為牛樟優(yōu)質(zhì)種源的保存與推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

10個牛樟種質(zhì)分別取自：①福建農(nóng)林大學(xué)植物園(農(nóng)大牛樟)；②南安市蓬華鎮(zhèn)蘇厝村將軍山(南安牛樟)；③永春縣東平鎮(zhèn)冷水村(永春牛樟1)；④永春縣東平鎮(zhèn)冷水村(永春牛樟2)；⑤德化縣龍潯鎮(zhèn)高陽村(德化牛樟)；⑥福建省林業(yè)科技試驗中心(南靖牛樟)；⑦漳浦縣揚(yáng)基生物科技有限公司(漳浦牛樟)；⑧漳州市龍海林下國有林場(林場牛樟)；⑨永安市貢坪采育場(永安牛樟1)；⑩永安市大西坑永林種苗中心(永安牛樟2)。其中，農(nóng)大牛樟與漳浦牛樟由種植人從臺灣引進(jìn)，并已通過臺灣專家鑒定。

1.2 DNA提取與檢測

2016年7月初采集發(fā)育良好且無病蟲害的牛樟嫩葉，采用改進(jìn)的十六烷基三甲基溴化銨法(cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB)提取DNA[12]。用Nano Drop ND-1000核酸蛋白檢測儀(Nano Drop Technologies Inc，美國)檢測DNA濃度，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量[13]。

1.3 SRAP-PCR擴(kuò)增與引物篩選

從16個正向和16個反向引物組合的256對引物中篩選出10對具有豐富多態(tài)性的SRAP引物組合(表1),進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增試驗。程序基本采用 Zhou et al[14]的方法，并稍作改良。

1.4 ISSR-PCR擴(kuò)增與引物篩選

從哥倫比亞大學(xué)公布的100個ISSR引物中篩選出10個具有豐富多態(tài)性的ISSR引物(表2)，進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增試驗。試驗基本參照劉玉香[15]的ISSR-PCR反應(yīng)體系。

1.5 統(tǒng)計與分析

篩選出SRAP與ISSR引物，觀察其擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖。在電泳圖譜中，遷移性一致的DNA條帶即具有同源性。采用人工讀圖的方式，將電泳圖上有清晰條帶的記為“1”，沒有條帶或者條帶不清晰的記為“0”。根據(jù)每對引物組合擴(kuò)增出來的條帶計算多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)目(number of polymorphic bands, NPB)、總擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)目(total number of bands, TNB)和多態(tài)性位點(diǎn)百分比(percentage of polymorphic bands, PPB)。公式：PPB=NPB/TNB。使用NTSYS 2.1統(tǒng)計分析軟件中Similarity程序計算10個牛樟種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)(genetic similarity, GS)，再用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method using arithmetic average algorithm, UPGMA)進(jìn)行聚類分析[16]。

表1 10對SRAP引物組合名稱和序列

表2 10個ISSR引物名稱和序列1)

1)R=(A,G),Y=(C,T),B=(C,G,T),D=(A,G,T),H=(A,C,T),V=(A,C,G)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛樟種質(zhì)資源的多態(tài)性分析

表3 10對SRAP引物組合的擴(kuò)增結(jié)果

(1)分別采用10對SRAP引物組合對10個牛樟種質(zhì)進(jìn)行DNA擴(kuò)增。結(jié)果表明，片段大小主要集中在50～2 000 bp，10對引物總共擴(kuò)增出251條條帶，其中220條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶百分比為87.6%(表3)。Em8-Me9和Em10-Me2這兩對引物組合產(chǎn)生的多態(tài)性條帶百分比最多，均達(dá)到100%(圖1)。(2)分別采用10個ISSR引物對10個牛樟種質(zhì)進(jìn)行DNA擴(kuò)增。結(jié)果表明，擴(kuò)增出來的片段大小主要集中在100～2 000 bp。10個引物總共擴(kuò)增出237條條帶，其中210條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶百分比為88.6%(表4)。UBC895和UBC900這兩個引物產(chǎn)生的多態(tài)性條帶百分比最多，均達(dá)到100%(圖2)。

A.Em8-Me9；B.Em10-Me2。1～10分別為：農(nóng)大牛樟、南安牛樟、永春牛樟1、永春牛樟2、德化牛樟、南靖牛樟、漳浦牛樟、林場牛樟、永安牛樟1、永安牛樟2。

2.2 牛樟種質(zhì)資源的遺傳相似性分析

表4 10個ISSR引物的擴(kuò)增結(jié)果

分別根據(jù)SRAP、ISSR結(jié)果，用NTSYS 2.1軟件計算10個牛樟種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)(表5、6)。從表5可見，牛樟種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.355～0.882之間，平均相似系數(shù)為0.606。從表6可見，牛樟種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.371～0.814之間，平均相似系數(shù)為0.606。

2.3 牛樟種質(zhì)資源的聚類分析

分別根據(jù)SRAP、ISSR擴(kuò)增結(jié)果和10個牛樟種質(zhì)間的遺傳相似性，利用UPGMA法建立系統(tǒng)聚類分支樹狀圖(圖3、4)。從圖3可見，在遺傳相似系數(shù)為0.43時可將10個牛樟種質(zhì)分成兩大類，即Ⅰ類包括農(nóng)大和漳浦牛樟，Ⅱ類包括南安、永春1、德化、永春2、南靖、林場、永安2和永安1牛樟。從圖4可見，在遺傳相似系數(shù)為0.41時可將10個牛樟種質(zhì)分成兩大類，即Ⅰ類包括農(nóng)大和漳浦牛樟，Ⅱ類包括南安、德化、永春1、永春2、永安2、南靖、永安1和林場牛樟。

2.4 SRAP與ISSR的結(jié)果比較

2.4.1 遺傳相似系數(shù) (1)SRAP標(biāo)記得到的10個牛樟種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.355～0.882之間，平均相似系數(shù)為0.606，農(nóng)大牛樟和永春牛樟1的遺傳相似系數(shù)(0.355)最小，永春牛樟1和德化牛樟(0.882)最大。將農(nóng)大牛樟與其余9個牛樟種質(zhì)相比，農(nóng)大牛樟與漳浦牛樟的遺傳相似系數(shù)(0.755)最大。

A.UBC895；B.UBC900。1～10分別為：農(nóng)大牛樟、南安牛樟、永春牛樟1、永春牛樟2、德化牛樟、南靖牛樟、漳浦牛樟、林場牛樟、永安牛樟1、永安牛樟2。

表5 10個牛樟種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)(SRAP)

Table 5 Genetic similarity coefficient of 10C.kanehiraebased on SRAP amplification profiles

牛樟農(nóng)大南安永春1永春2德化南靖漳浦林場永安1永安2農(nóng)大1.000南安0.3821.000永春10.3550.8731.000永春20.4950.7050.6501.000德化0.3640.8450.8820.6771.000南靖0.4140.6860.6770.7820.7051.000漳浦0.7550.4450.4360.4680.4090.4051.000林場0.4360.7180.6730.7860.6730.8320.4821.000永安10.3680.6230.6590.5910.6320.6270.4860.6231.00永安20.3730.7000.6550.7770.6910.8230.4270.8360.6591.00

表6 10個牛樟種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)(ISSR)

圖3 10個牛樟種質(zhì)的SRAP聚類圖

圖4 10個牛樟種質(zhì)的ISSR聚類圖

(2)ISSR標(biāo)記得到的10個牛樟種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.371～0.814之間，平均相似系數(shù)為0.606。永春牛樟2和漳浦牛樟的遺傳相似系數(shù)(0.371)最小，南安牛樟和德化牛樟的遺傳相似系數(shù)(0.814)最大。將農(nóng)大牛樟與其余9個牛樟種質(zhì)相比，農(nóng)大牛樟與漳浦牛樟的遺傳相似系數(shù)(0.743)最大。將SRAP與ISSR數(shù)據(jù)整合得到的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.412～0.847之間，平均相似系數(shù)為0.603，所得結(jié)果均與SRAP一致。

2.4.2 聚類分析 SRAP和ISSR分子標(biāo)記的聚類分析圖略有不同，具體表現(xiàn)為SRAP將永安牛樟1單獨(dú)分在Ⅱb類，而ISSR將林場牛樟單獨(dú)分在Ⅱb類。將SRAP與ISSR數(shù)據(jù)整合得到的聚類分析結(jié)果與SRAP的結(jié)果更具有一致性，除了林場牛樟和永安牛樟2順序稍有不同，其他分類幾乎相同。

利用Mantel檢驗SRAP、ISSR和SRAP+ISSR三者相似系數(shù)的相關(guān)性，SRAP與ISSR之間的相關(guān)系數(shù)為0.864；SRAP與SRAP+ISSR之間的相關(guān)系數(shù)為0.977；ISSR與SRAP+ISSR之間的相關(guān)系數(shù)為0.952。以上表明，SRAP和ISSR遺傳相似系數(shù)都與SRAP+ISSR數(shù)據(jù)整合得到的遺傳相似系數(shù)的相關(guān)性較高，SRAP標(biāo)記更接近于兩標(biāo)記的綜合遺傳多樣性。

3 討論

遺傳相似系數(shù)對鑒別牛樟種質(zhì)有著重要意義。本研究表明，SRAP分析中農(nóng)大牛樟與漳浦牛樟的遺傳相似系數(shù)為0.755，與其余8個種質(zhì)遺傳相似系數(shù)均低于0.500。ISSR分析中，農(nóng)大牛樟與漳浦牛樟的遺傳相似系數(shù)為0.743，與其他牛樟均低于0.530。農(nóng)大牛樟與漳浦牛樟已鑒定為臺灣牛樟[8,17]，本研究結(jié)果也證明了兩者為同一種源。

本研究通過SRAP與ISSR分子標(biāo)記技術(shù)將10個牛樟種質(zhì)完全鑒別出來,說明這兩種分子標(biāo)記技術(shù)對植物的鑒別均具有一定的可靠性。兩者也存在一定的差異性，由于SRAP分子標(biāo)記是對開放閱讀框進(jìn)行特異性的擴(kuò)增[18]，而ISSR分子標(biāo)記檢測的是位于反向排列的簡單重復(fù)序列間的基因組DNA片段[19]。SRAP、ISSR均與SRAP+ISSR相關(guān)性較強(qiáng)，說明利用2種或2種以上的分子標(biāo)記相結(jié)合，具有較高的可信性和一致性[20]。SRAP+ISSR的聚類分析結(jié)果與SRAP更具一致性，除林場牛樟和永安牛樟2順序稍有不同，其他分類幾乎相同。因此，在經(jīng)濟(jì)條件有限的情況下，僅使用SRAP分子標(biāo)記便可達(dá)到良好的鑒別效果。

目前關(guān)于牛樟分子標(biāo)記技術(shù)體系的研究甚少，本文首次采用SRAP與ISSR分子標(biāo)記鑒定牛樟種質(zhì)，為有效鑒別牛樟與雜樟奠定基礎(chǔ)。