劉礎(chǔ)榮 董玥 呂青陽

摘要 采用菌絲生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)抑制法，測(cè)定了14種殺菌劑單劑及基于單劑篩選結(jié)果的二元復(fù)配劑對(duì)紅棗黑斑病菌Alternaria tenuissima菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制作用，以此評(píng)價(jià)防治紅棗黑斑病的殺菌劑和復(fù)配藥劑的效果。結(jié)果表明，咯菌腈和嘧菌環(huán)胺對(duì)靶標(biāo)病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最佳，其EC50分別為0.091 3和0.099 8 μg/mL;吡唑醚菌酯和啶酰菌胺對(duì)病菌孢子萌發(fā)抑制效果最佳，其EC50分別為0.015 3和0.293 4 μg/mL。吡唑醚菌酯與戊唑醇按照8∶2和3∶7（w/w）的比例進(jìn)行復(fù)配，對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制表現(xiàn)出相加作用，其SR值分別為1.124 5和0.916 9;兩者以5∶5和3∶7（w/w）的比例進(jìn)行復(fù)配，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制表現(xiàn)出相加作用，其SR值分別為1.164 6和0.901 0。吡唑醚菌酯、啶酰菌胺、咯菌腈、嘧菌環(huán)胺和異菌脲等對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有抑制效果;吡唑醚菌酯與戊唑醇3∶7（w/w）復(fù)配對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的抑制效果均表現(xiàn)出相加作用。上述結(jié)果為紅棗黑斑病防治藥劑的開發(fā)和后續(xù)田間應(yīng)用提供了理論支持。

關(guān)鍵詞 紅棗黑斑病; 鏈格孢菌; 毒力測(cè)定; 藥劑復(fù)配

中圖分類號(hào)： S 432.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： B ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018438

Abstract In order to evaluate the effect of fungicides for controlling black spot of jujube （Ziziphus jujuba）， 14 fungicides as well as their cocktail mixture were screened by measuring the mycelial growth and spore germination. The results indicated that mycelial growth of Alternaria tenuissima was strongly inhibited by fludioxonil and cyprodinil， with the EC50 values of 0.091 3 and 0.099 8 μg/mL， respectively. The spore germination was strongly inhibited by pyraclostrobin and boscalid， with the EC50 values of 0.015 3 and 0.293 4 μg/mL， respectively. The mixture of pyraclostrobin and tebuconazole had an additive effect on the inhibition of mycelial growth at the ratio of 8∶2 or 3∶7（w/w）， with the synergistic ration （SR） value of 1.124 5 and 0.916 9， respectively. The mixture of these two fungicides also had an additive effect on the inhibition of spore germination at the ratio of 5∶5 or 3∶7（w/w）， with the SR value of 1.164 6 and 0.901 0， respectively. In conclusion， pyraclostrobin， boscalid， fludioxonil， cyprodinil and iprodione showed inhibition effects on mycelial growth and spore germination. The mixture of pyraclostrobin and tebuconazole at the ration of 3∶7 had additive effect both on mycelial growth and spore germination， indicating that these fungicides and mixture supplied an alternative choice for jujube black spot disease control in field.

Key words jujube black spot; Alternaria sp.; toxicity test; fungicide mixture

棗樹 Ziziphus jujuba為鼠李科棗屬植物。紅棗是我國特有的優(yōu)質(zhì)水果。我國擁有全世界98%的紅棗種質(zhì)資源，并為世界貢獻(xiàn)了99%的紅棗產(chǎn)量[1-2]。近年來，新疆已經(jīng)成為我國最重要的優(yōu)質(zhì)商品紅棗生產(chǎn)基地，在喀什、阿克蘇及和田形成了三大紅棗主產(chǎn)區(qū)。據(jù)2016年國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)[3]，新疆紅棗年產(chǎn)量326.42萬t，居全國第一。伴隨紅棗產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，棗園病害發(fā)生嚴(yán)重，其中紅棗黑斑病自2009年在和田等地首次發(fā)現(xiàn)，2010年在阿克蘇地區(qū)大面積發(fā)生[4]，2013年南疆多個(gè)地區(qū)再次大面積發(fā)生，果實(shí)發(fā)病率高達(dá)20%～30%，嚴(yán)重危害紅棗產(chǎn)量和品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。

引起新疆維吾爾自治區(qū)紅棗黑斑病的主要病原菌為細(xì)極鏈格孢Alternaria tenuissima[6]。該病原菌可引起多種植物病害，曾導(dǎo)致美國伊利諾伊州大豆發(fā)生猝倒病而減產(chǎn)15%[7];該菌在印度引起茄子葉斑和茄果腐爛病[8]，在伊朗引起草莓葉斑病[9]。在國內(nèi)也有細(xì)極鏈格孢引起五味子黑斑病[10]和棗縮果病[11-12]的報(bào)道。該病原菌除引起病害還能夠產(chǎn)生交鏈格孢霉烯和鏈格孢酚等真菌毒素，嚴(yán)重威脅食品安全[13]。

目前，新疆地區(qū)主要通過施用化學(xué)藥劑防控紅棗黑斑病，但缺少針對(duì)紅棗黑斑病的高效藥劑[14]以及更加科學(xué)的施藥方案。因此，本文針對(duì)防治紅棗黑斑病的殺菌劑進(jìn)行了單劑篩選和Wadley法復(fù)配研究，旨在為紅棗黑斑病防治藥劑的開發(fā)和田間應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試藥劑

供試的14種殺菌劑均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系種子病理與殺菌劑藥理學(xué)研究室提供（表1）。

1.1.2 靶標(biāo)病菌

引起紅棗黑斑病的細(xì)極鏈格孢A.tenuissima菌株由塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖18 g，瓊脂粉14 g，去離子水1 L。

水瓊脂：瓊脂粉10 g，去離子水1 L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化

將供試菌株接種在PDA平板上，28℃黑暗培養(yǎng)5 d后備用。

1.2.2 殺菌劑對(duì)A.tenuissima菌絲生長(zhǎng)的影響

采用中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) （NY/T1156.2-2006）中的平皿菌絲生長(zhǎng)抑制法進(jìn)行試驗(yàn)[16]。供試殺菌劑均以二甲基亞砜為溶劑配制為1 000 μg/mL的母液，再依次稀釋為100、10、1、0.5、0.1、0.01和0.001 μg/mL 7個(gè)濃度，制成含藥PDA平板。以添加等體積的溶劑和蒸餾水作為溶劑和空白對(duì)照。用直徑5 mm的打孔器在靠近菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅并接種到不同濃度的含藥PDA平板中央，每濃度3次重復(fù)。28℃黑暗培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，計(jì)算相對(duì)抑制率。

相對(duì)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%;

以設(shè)定濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（x），抑制率幾率值為縱坐標(biāo)（y），求出各藥劑對(duì)供試病菌的毒力回歸曲線方程y=ax+b、決定系數(shù)R2以及有效抑制中濃度（EC50）。最后根據(jù)EC50，分析比較不同殺菌劑對(duì)供試病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.3 殺菌劑對(duì)A.tenuissima孢子萌發(fā)的影響

將5 mm的A.tenuissima菌餅菌絲面朝下接種到PDA平板中央，28℃黑暗培養(yǎng)8 d，待菌絲鋪滿整個(gè)平板后加入10 mL無菌水洗脫孢子，用4層紗布過濾獲得孢子懸浮液。加入無菌水制備成濃度為1×106個(gè)/mL的分生孢子懸浮液[17]。吸取150 μL分生孢子懸浮液均勻涂布在含不同濃度藥劑的水瓊脂平板上，25℃黑暗培養(yǎng)6 h后鏡檢（放大倍數(shù)10×10），每濃度3次重復(fù)，每次重復(fù)調(diào)查100個(gè)分生孢子。孢子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)為芽管長(zhǎng)超過孢子長(zhǎng)度的一半[18]。計(jì)算殺菌劑對(duì)紅棗黑斑病菌分生孢子萌發(fā)的抑制率。

孢子萌發(fā)率=（萌發(fā)孢子數(shù)/孢子總數(shù)）×100%;

相對(duì)抑制率=（對(duì)照組孢子萌發(fā)率-處理組孢子萌發(fā)率）/對(duì)照組孢子萌發(fā)率×100%。

1.2.4 殺菌劑復(fù)配設(shè)計(jì)

根據(jù)供試殺菌劑單劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的EC50測(cè)定結(jié)果，最終選取吡唑醚菌酯和戊唑醇進(jìn)行復(fù)配，評(píng)價(jià)藥劑混用后的聯(lián)合作用。將吡唑醚菌酯和戊唑醇按2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2等進(jìn)行復(fù)配，測(cè)定復(fù)配劑對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的EC50，同時(shí)按Wadley法計(jì)算增效系數(shù)（SR）。SR<0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR>1.5為增效作用[19]。

SR=EC50（理論）/EC50（實(shí)際）;

EC50（理論）=a+baEC（A）50+bEC（B）50。

a、b分別為相應(yīng)單劑在復(fù)配劑中所占比例，A、B分別為吡唑醚菌酯和戊唑醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試殺菌劑單劑對(duì)A.tenuissima菌絲生長(zhǎng)的影響

藥劑對(duì)A.tenuissima菌絲生長(zhǎng)的影響如表2所示?？┚婧袜拙h(huán)胺對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最佳，其EC50分別為0.091 3和0.099 8 μg/mL;其次為異菌脲、咪鮮胺、己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鮮胺錳鹽、氟硅唑和苯醚甲環(huán)唑，其EC50范圍在0.268 8～0.515 6 μg/mL;丙環(huán)唑、啶酰菌胺、腐霉利、嘧菌酯和戊唑醇的EC50范圍在1.188 8～3.256 1 μg/mL。

2.2 供試殺菌劑單劑對(duì)A.tenuissima孢子萌發(fā)的影響 ?供試藥劑對(duì)A.tenuissima孢子萌發(fā)的影響如表3所示。其中，吡唑醚菌酯對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果最佳，EC50為0.015 3 μg/mL;其次為啶酰菌胺，EC50為0.293 4 μg/mL;嘧菌酯、異菌脲、咯菌腈和腐霉利的EC50范圍在1.692 4～4.016 4 μg/mL;嘧菌環(huán)胺的EC50為19.134 μg/mL。7種細(xì)胞膜甾醇合成抑制劑在供試濃度下對(duì)A.tenuissima孢子萌發(fā)均沒有抑制效果。

2.3 供試殺菌劑復(fù)配藥劑對(duì)A.tenuissima菌絲生長(zhǎng)的影響 ?吡唑醚菌酯和戊唑醇的不同配比組合對(duì)A.tenuissima菌絲生長(zhǎng)的影響如表4所示。除吡唑醚菌酯∶戊唑醇=5∶5（w/w，下同）表現(xiàn)出拮抗作用外，其余6種配比均表現(xiàn)出相加作用。其中吡唑醚菌酯∶戊唑醇=8∶2時(shí)增效最明顯，其SR值為1.124 5;其次為3∶7和2∶8的配比組合，其SR值分別為0.916 9和0.818 4;吡唑醚菌酯和戊唑醇的配比為6∶4、7∶3和4∶6時(shí)相加作用不顯著。

2.4 供試殺菌劑復(fù)配藥劑對(duì)A.tenuissima孢子萌發(fā)的影響 ?吡唑醚菌酯和戊唑醇的不同配比組合對(duì)A.tenuissima孢子萌發(fā)的影響如表5所示，其中吡唑醚菌酯：戊唑醇=5∶5時(shí)相加作用最為明顯（SR值=1.164 6），3∶7、2∶8、6∶4和4∶6 4個(gè)配比也表現(xiàn)為相加作用，其SR值分別為0.901 0、0.798 3、0.720 2和0.520 6，而8∶2和7∶3表現(xiàn)為拮抗作用。

3 結(jié)論與討論

本研究選用14種殺菌劑單劑對(duì)A.tenuissima進(jìn)行了菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)，結(jié)果表明咯菌腈、嘧菌環(huán)胺、異菌脲、咪鮮胺、己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鮮胺錳鹽、氟硅唑和苯醚甲環(huán)唑等9種藥劑對(duì)A.tenuissima菌絲生長(zhǎng)有抑制活性;吡唑醚菌酯和啶酰菌胺對(duì)病原菌孢子萌發(fā)有抑制效果;以三唑類為代表的麥角甾醇生物抑制劑對(duì)病原菌孢子萌發(fā)均沒有明顯的抑制效果，這與麥角甾醇生物合成抑制劑的作用機(jī)理相關(guān)，有研究認(rèn)為麥角甾醇生物抑制劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)有顯著影響，但不影響孢子萌發(fā)[20]。這與本研究結(jié)果一致。

吡唑醚菌酯的作用機(jī)理是阻止呼吸作用復(fù)合物Ⅲ中細(xì)胞色素b和c1之間的電子傳遞，使線粒體無法為細(xì)胞提供能量而導(dǎo)致其死亡，達(dá)到殺死病原菌的目的。吡唑醚菌酯能抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)也能抑制孢子萌發(fā)，具有治療、保護(hù)、鏟除、強(qiáng)內(nèi)吸性及耐雨水沖刷等特性[21-22]，已被用于許多真菌病害的防治，且在大豆[23]、玉米[24]及棉花[25]等作物上的保健、增產(chǎn)和促生作用被不斷證明;戊唑醇是1986年德國拜耳公司開發(fā)的一種高效、廣譜、低毒的三唑類殺菌劑，其作用機(jī)理是抑制真菌細(xì)胞壁中麥角甾醇中間體的氧化脫甲基反應(yīng)從而抑制病原菌生長(zhǎng)[26]，具有保護(hù)、治療、鏟除及持效期長(zhǎng)等特性。

吡唑醚菌酯和戊唑醇均為高效、廣譜、低毒的殺菌劑，且作用類型不同。本文選擇這兩種藥劑進(jìn)行復(fù)配，研究其單劑和復(fù)配劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響，采用Wadley法計(jì)算復(fù)配藥劑的增效系數(shù)，最終獲得了對(duì)A.tenuissima菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)抑制均表現(xiàn)出相加作用最優(yōu)復(fù)配組合。

紅棗黑斑病是近年來流行在新疆紅棗產(chǎn)區(qū)的主要病害之一，對(duì)紅棗的生產(chǎn)和品質(zhì)造成了嚴(yán)重的影響，多種殺菌劑交替使用或運(yùn)用復(fù)配藥劑可以緩解由于長(zhǎng)期施用單一殺菌劑產(chǎn)生的抗藥性問題，延長(zhǎng)殺菌劑的使用壽命。另一方面，戊唑醇的價(jià)格遠(yuǎn)低于吡唑醚菌酯，二者復(fù)配還能降低田間用藥成本。本研究為紅棗黑斑病的科學(xué)用藥提供了理論支持。但在自然條件下，由于氣候、施藥時(shí)期和方式、藥劑與病原菌的接觸程度等因素，室內(nèi)毒力測(cè)定試驗(yàn)的結(jié)果往往與田間試驗(yàn)獲得的結(jié)果有一定偏差。因此，本研究篩選出的單劑和混劑配比還需田間試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] 池振江.適于新疆紅棗主要病蟲害防治的生物農(nóng)藥篩選及應(yīng)用[D].石河子：石河子大學(xué)，2014.

[2] SUN Liang，JIANG Juan.Effect of jujube extract on oxidative injury in heart muscles of exhausted training rats [J].African Journal of Microbiology Research，2011，5（14）：1896-1899.

[3] 國家統(tǒng)計(jì)局.紅棗產(chǎn)量分省年度數(shù)據(jù)[DB/OL].2016.http：∥data.stats.gov.cn/easyquery.htm？cn-E0103.

[4] 王蘭，馮宏祖，支金虎，等.32.5%苯甲·嘧菌酯懸浮劑對(duì)棗黑斑病的室內(nèi)毒力測(cè)定與田間防效試驗(yàn)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（1）：134-135.

[5] 符澤.新疆阿拉爾墾區(qū)矮化密植棗園紅棗黑斑病發(fā)病規(guī)律的初步研究[D].石河子：石河子大學(xué)，2015.

[6] 李夏鳴，郭黃萍，胡增麗.棗黑斑病研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（11）：37-40.

[7] 董寧.棗黑斑病癥狀表現(xiàn)、病菌分析及室內(nèi)藥劑篩選[D].阿拉爾：塔里木大學(xué)，2015.

[8] RAJA P，REDDY A V R，ALLAM U S.First report of Alternaria tenuissima causing leaf spot and fruit rot on eggplant （Solanum melongena） in India[J].Plant Pathology，2006，55（4）：579.

[9] BAGHERABADI S，ZAFARI D，SOLEIMANI M J.First Report of leaf spot of strawberry caused by Alternaria tenuissima in Iran [J]. Journal of Plant Pathology & Microbiology， 2015， 6（3）：258.

[10] 許偉民，謝昀燁，王春偉，等.北五味子黑斑病的藥劑防治[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013（5）：520-529.

[11] 鄭曉蓮，趙光耀，茆正川，等.棗縮果病病原診斷初報(bào)[J].植物保護(hù)，1995，32（2）：19-21.

[12] 鄭曉蓮，齊秋鎖，趙光耀，等.棗縮果病初侵染來源的初步研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，18（4）：59-63.[13] TAN C ˇINOV D，MAKOV Z，RYBRIK L，et al.，Colonization of grapes berries by Alternaria sp.and their ability to produce mycotoxins [J].Potravinarstvo，2016，10（1）：7-13.

[14] 蔡龍.紅棗黑斑病發(fā)病研究及藥劑防治試驗(yàn)[J].山西果樹，2013（3）：3-5.

[15] Fungicide Resistance Action Committee.Fungicides sorted by mode of action （including FRAC Code numbering）[J/OL].[2018-2].http：∥www.frac.info/publications/downloads.

[16] 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所.NY/T1156.2-2006，抑制病原真菌菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn)平皿法[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：1-2.

[17] 陳鳳平，韓平，張真真，等.啶菌噁唑?qū)Ψ鸦颐共【囊志饔醚芯縖J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010（1）：42-48.

[18] 古麗皮艷，韓青梅，王蘭.不同殺菌劑對(duì)玉米彎孢葉斑菌的毒力測(cè)定[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，33（S1）：49-52.

[19] 耿忠義，趙京嵐，孫國波，等.腈菌唑與甲基硫菌靈對(duì)蘋果輪紋病等3種病菌混配增效作用研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010（18）：297-300.

[20] SIEGEL M R.Sterol-inhibiting fungicides：effects on sterol biosynthesis and sites of action [J].Plant Disease，1981，65（12）：986-989.

[21] BAYLIS A.Agrochemicals coming off-patent 2012-2016 [R].London：Informa UK Ltd，2011：68-70.

[22] 楊麗娟，柏亞羅.甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑—吡唑醚菌酯[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2012（4）：46-50.

[23] 陳雨，張愛芳，夏本勇，等.吡唑醚菌酯對(duì)大豆炭疽病防效及保健增產(chǎn)作用[J].農(nóng)藥，2011（9）：697-699.

[24] 于曉麗，王培松，巴信斌，等.17.2%吡唑醚菌酯·氟環(huán)唑懸乳劑對(duì)玉米的防病保健作用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（25）：92-95.

[25] 陳雨，張愛芳，於春，等.吡唑醚菌酯對(duì)棉花炭疽病的防效及保健增產(chǎn)作用[J].中國棉花，2011（6）：24-26.

[26] 華乃震.殺菌劑戊唑醇的劑型與應(yīng)用[J].農(nóng)藥，2013，52（11）：781-786.

（責(zé)任編輯： 楊明麗）