曹業(yè)凡 汪來發(fā) 王曦茁

摘要 為確定四川省蓬溪縣九葉青花椒種植區(qū)發(fā)病植株花椒根結(jié)線蟲的種類，進(jìn)而為九葉青花椒根結(jié)線蟲病防治提供依據(jù)，本文根據(jù)根結(jié)線蟲雌蟲與2齡幼蟲的形態(tài)特征及雌成蟲的會陰花紋、雌蟲酯酶同工酶圖譜，并結(jié)合特異性擴(kuò)增及rDNA-ITS擴(kuò)增，根據(jù)ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對該地區(qū)九葉青花椒根結(jié)線蟲病的病原進(jìn)行了種類鑒定。結(jié)果表明該病原為南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita （Kofold & White） Chitwood。這是我國首次在九葉青花椒上發(fā)現(xiàn)南方根結(jié)線蟲。

關(guān)鍵詞 九葉青花椒; 南方根結(jié)線蟲; rDNA-ITS

中圖分類號： S 435.73， S 432.45 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018402

Abstract In order to confirm the species of root-knot nematode on Zanthoxylum armatum var. novemfolius in Pengxi County， Sichuan province and provide the reference for prevention and controlling with root-knot disease， the nematode was identified by morphological observation， biochemical observation， specific amplification and rDNA-ITS sequence analysis. The results showed that the root-knot nematode on Z.armatum var. novemfolius was Meloidogyne incognita （Kofold & White） Chitwood. This is the first report of M.incognita on Z.armatum var. novemfolius in China.

Key words Zanthoxylum armatum var. novemfolius; Meloidogyne incognita; rDNA-ITS

九葉青花椒Zanthoxylum armatum DC.var. novemfolius Hong Ping Deng隸屬蕓香科Rutaceae花椒屬Zanthoxylum，為竹葉花椒Z.armatum一變種。九葉青花椒起源于重慶江津區(qū)，目前在重慶、四川及貴州等省市有廣泛栽培[1]。九葉青花椒與其他花椒種類Zanthoxylum spp.相比，具有花序多、花期較早，果實(shí)產(chǎn)量大、品質(zhì)好等優(yōu)勢[2]，因此成為當(dāng)?shù)刂饕?jīng)濟(jì)作物，并逐漸成為四川、重慶等省區(qū)退耕還林的首選樹種[3]。隨著九葉青花椒種植的集約化與樹齡的增長，各大九葉青花椒產(chǎn)區(qū)的花椒病蟲害開始暴發(fā)，如銹病、黑脛病、流膠病、煤污病等[4-5]。近幾年來，在四川省遂寧市蓬溪縣及周邊地區(qū)，發(fā)現(xiàn)九葉青花椒感染根結(jié)線蟲，致使九葉青花椒生長不良，產(chǎn)量下降，感病嚴(yán)重的地塊，20%～30%的九葉青花椒樹死亡。為鑒定四川蓬溪縣九葉青花椒根結(jié)線蟲病害病原，2016年5月至8月間，對蓬溪縣寶梵鎮(zhèn)和新星鄉(xiāng)等鄉(xiāng)鎮(zhèn)的九葉青花椒產(chǎn)地進(jìn)行病害調(diào)查，并采集發(fā)病嚴(yán)重的九葉青花椒上的根結(jié)線蟲樣品帶回室內(nèi)進(jìn)行純化培養(yǎng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生物化學(xué)特征與分子生物學(xué)特征進(jìn)行分析和鑒定，以期為九葉青花椒根結(jié)線蟲病害的綜合防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與病害調(diào)查

在四川省寶梵鎮(zhèn)和新星鄉(xiāng)九葉青花椒種植區(qū)采集感病花椒樣品，使用隨機(jī)取樣法，對感病植株根部及其周圍的病土進(jìn)行采取，取樣深度為表層土10～30 cm，各樣地隨機(jī)設(shè)置5個采樣點(diǎn)，完成采樣后將樣品混勻放入同一個采集袋內(nèi)并標(biāo)記樣品。將采集的標(biāo)樣帶回實(shí)驗(yàn)室，在顯微鏡下挑取單卵塊。將易感病品種‘918粉紅種植于滅菌培養(yǎng)土中，待長出兩片真葉時，將卵塊接種于培養(yǎng)土中，培養(yǎng)60 d后進(jìn)行病原鑒定[6]。

1.2 花椒根結(jié)線蟲的獲得

雌蟲的分離與收集：經(jīng)單卵塊接種后的番茄苗培養(yǎng)60 d后，取感染線蟲的番茄根用清水洗凈，在體視顯微鏡下用鑷子或解剖針針尖將根結(jié)表皮輕輕挑開，剖面出現(xiàn)的乳白色的光滑梨形物即為根結(jié)線蟲的雌蟲，用解剖針輕輕撥出，放入水中待用。

2齡幼蟲的收集：室內(nèi)單卵塊繁殖60 d后，將番茄病根帶回室內(nèi)清洗并剪成1～3 cm的小段，將根段裝入500 mL三角瓶中后倒入300 mL的1%次氯酸鈉溶液，封口后猛搖3 min，立即用蒸餾水沖洗數(shù)次，先后過200目和500目篩，用蒸餾水反復(fù)沖洗留在500目篩子上的卵，最后用無菌水沖洗收集于無菌的小燒杯中。將上述卵放于26℃無菌培養(yǎng)箱中孵化3 d，得到根結(jié)線蟲的2齡幼蟲[5]。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

觀察頭部特征、口針特征等。測量20條線蟲體長、最大體寬、口針長和DEGO（背食道腺開口至口針基部球的距離）等形態(tài)指標(biāo)。

雌成蟲會陰花紋的制作與觀察：參照王曦茁等[7]的方法，在體視顯微鏡下解剖根結(jié)線蟲的成熟雌蟲，將雌蟲移入硬塑料板上的一滴體積分?jǐn)?shù)45%乳酸中，用解剖刀切取尾端（蟲體后部約1/4處），將尾端的體內(nèi)組織去掉，切除尾端表皮多余的部分，僅留下會陰花紋部分。將會陰花紋轉(zhuǎn)移至一塊載玻片上的純甘油滴中，一個玻片上放10塊會陰花紋，以AFG液為浮載劑，用樹脂封片，制成永久玻片。在顯微鏡下觀察會陰花紋的形態(tài)特征并拍照。

1.4 同工酶鑒定

參照文獻(xiàn)[8-9]，通過垂直板聚丙烯凝膠電泳做酯酶分析。首先配制浸提液（20%蔗糖+2%TritonX-100）、1 mol/L Tris-HCl pH 8.9緩沖液、1 mol/L Tris-HCl pH 8.3緩沖液、1 mol/L Tris-HCl pH 6.8緩沖液、1%過硫酸銨溶液、0.2%溴酚藍(lán)。用移液器吸取5 μL浸提液至離心管中，將成熟雌蟲轉(zhuǎn)入管內(nèi)，用研磨錐充分研磨，補(bǔ)加10 μL浸提液浸提酯酶同工酶。聚丙烯酰胺濃度分別為3%和7%。板大小為150 mm×120 mm，凝膠厚度1.5 mm，電極緩沖液為1 mol/L pH 8.3 Tris-HCl緩沖液。每孔加樣量為20 μL（含濃度為1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液），電泳前30 min電壓設(shè)為80 V，之后在190 V下電泳2 h，直到溴酚藍(lán)指示條帶遷移距離達(dá)到10 cm。電泳結(jié)束后進(jìn)行染色，顯色完全后用蒸餾水漂洗3次，之后在固定液（10%醋酸+10%甘油）中固定3 h以上，酯酶表型的命名參照文獻(xiàn)[9]，以室內(nèi)培育已鑒定的南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita樣本作為參照系判讀酯酶譜型，初步確定根結(jié)線蟲的種類。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

1.5.1 DNA提取

根結(jié)線蟲的DNA提取方法參照磁珠法基因組提取試劑盒（天根）說明書并稍作優(yōu)化。對花椒病根進(jìn)行解剖，挑取根結(jié)線蟲成熟雌蟲，將根結(jié)線蟲雌蟲置于離心管并與研磨錐一同放入液氮中預(yù)冷后，用研磨錐研磨樣品，加入20 μL蛋白酶K，經(jīng)水浴裂解30 min后，加入350 μL異丙醇，振蕩混勻后加入30 μL磁珠懸浮液，振蕩混勻后靜置3 min，反復(fù)3次;將離心管置于磁力架上，靜置。待磁珠完全吸附后，吸棄液體;加入700 μL緩沖液，振蕩混勻，吸棄液體;加入700 μL漂洗液，振蕩混勻后置于磁力架上靜置，吸棄液體后，將離心管置于室溫晾干;將離心管取下并加入200 μL洗脫緩沖液并振蕩混勻，56℃水浴10 min。之后將離心管置于磁力架上靜置2 min，待磁珠完全吸附后，吸取DNA溶液并置于新離心管內(nèi)，之后將DNA產(chǎn)物保存至-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 PCR擴(kuò)增

采用根結(jié)線蟲ITS擴(kuò)增通用引物[10]以及南方根結(jié)線蟲特異性引物[11]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ITS片段擴(kuò)增引物名稱分別為F195：5′-TCC TCC GCT AAA TGA TAT G-3′和V5367：5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′，特異性擴(kuò)增引物名稱分別為：MiSF：5′-GGG CAA GTA AGG ATG CTC TG-3′和MiSD：5′-GCA CCT CTT TCA TAG CCA CG-3′。PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系：12.5 μL 2×FastLong Taq PCR MsaterMix， 1 μL上游引物（10 μmol/L），1 μL下游引物 （10 μmol/L），1 μL DNA，9.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min;94℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，反應(yīng)共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。4℃保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠110 V電泳30 min進(jìn)行檢測，用1×TAE作為電泳緩沖液，并在紫外燈下觀測照相。

1.5.3 產(chǎn)物克隆與測序

將純化后的ITS-PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒載體pMD18-T（TaKaRa）上，選取每種群各5個陽性克隆由擎科公司測序。利用NCBI中的BLAST工具和DNAMAN 9.0軟件，將獲得的rDNA-ITS區(qū)序列與GenBank已登錄的根結(jié)線蟲序列進(jìn)行比對分析。利用MEGA 6.0軟件通過鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Maximum Composite Likelihood模型。同時對構(gòu)建的系統(tǒng)樹作自展檢驗(yàn)（bootstrap test）以獲得分支的支持率，自展檢驗(yàn)中重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000次，以秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans （X03680）的ITS序列作為外群。

2 結(jié)果與分析

2.1 九葉青花椒根結(jié)線蟲病癥狀

九葉青花椒感染根結(jié)線蟲后，植株矮小，葉片發(fā)黃、失綠，生長緩慢，感病嚴(yán)重的地塊，20%～30%的九葉青花椒樹死亡。九葉青花椒感病后其主根及根尖處開始膨大，并慢慢形成白色米粒狀根結(jié)，隨后側(cè)根根部也出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，并形成不規(guī)則白色米粒狀根結(jié)，隨著病情加重，根結(jié)逐漸膨大，顏色由白色變?yōu)辄S色，當(dāng)根部腐爛壞死時根結(jié)變成黑色，其根結(jié)主要分布在10～30 cm土層。剖開米粒狀根結(jié)可見白色梨形雌蟲，說明九葉青花椒樹已感染根結(jié)線蟲。

2.2 根結(jié)線蟲形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

雌蟲：體白色，梨形，頸短，頭區(qū)有不完整的環(huán)紋，口針纖細(xì)，口針基球呈扁圓形，同桿部的界線明顯;口針錐部向背部明顯彎曲，桿部末端較寬。

2齡幼蟲：蟲體呈線形，蠕蟲狀;頭冠前端平寬，頭部無突出與縊縮，有不完整環(huán)紋;口針纖細(xì)，錐部與桿部中等寬，基部縊縮且向后傾斜;尾有透明區(qū)。

會陰花紋：背弓高，呈方形，由平滑到波浪形的線紋組成。線紋在側(cè)面分叉，側(cè)線不明顯，線紋彎向陰門，尾端區(qū)無刻點(diǎn)（圖1）。

雌蟲與2齡幼蟲部分體長測量值如表1，參考文獻(xiàn)[12-14]，初步確定九葉青花椒根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲M.incognita。

2.3 酯酶同工酶酶譜

將分離純化的根結(jié)線蟲種群進(jìn)行同工酶分析，電泳結(jié)果如圖2，該種群根結(jié)線蟲雌成蟲的酯酶同工酶譜均出現(xiàn)一條酯酶帶，酯酶譜帶類型為I1，相對遷移率為0.47，與南方根結(jié)線蟲相同，因此確定該根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲。

2.4 分子生物學(xué)特征

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測ITS-PCR產(chǎn)物與特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果，表明九葉青花椒根結(jié)線蟲樣本的rDNA-ITS片段大小為700 bp左右（圖3），特異性擴(kuò)增產(chǎn)物大小為500 bp左右（圖4），其ITS片段以及特異性擴(kuò)增片段同南方根結(jié)線蟲的產(chǎn)物片段長度基本一致。將ITS-PCR產(chǎn)物所挑取的陽性克隆送至公司測序，通過DNAMAN 9.0拼接得到695 bp的ITS序列。將該序列上傳至GenBank上進(jìn)行BLAST，結(jié)果表明，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物ITS區(qū)域序列與已知南方根結(jié)線蟲ITS區(qū)域序列的相似性達(dá)到99%。用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，5個九葉青花椒根結(jié)線蟲的ITS序列與南方根結(jié)線蟲的遺傳距離最近，支持率為97%，而與其他根結(jié)線蟲的遺傳距離相對較遠(yuǎn)。結(jié)合其ITS系統(tǒng)發(fā)育樹以及特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，參照文獻(xiàn)[10-11]并進(jìn)行條帶比較，說明在四川省發(fā)生的九葉青花椒根結(jié)線蟲病的病原為南方根結(jié)線蟲。

3 結(jié)論與討論

磁珠法提取DNA適用于微量材料DNA提取，提取的DNA純度高，濃度高，不含抑制劑，提取過程中無需過柱與離心，可有效避免提取微量材料的DNA時出現(xiàn)DNA損失，目前主要用于植物與動物DNA提取，廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域[15-16]。目前國內(nèi)尚未報(bào)道磁珠法用于提取線蟲DNA，常規(guī)根結(jié)線蟲的DNA提取方法主要通過裂解凍融法[17]，本文首次利用磁珠法成功提取根結(jié)線蟲DNA。通過對根結(jié)線蟲rDNA-ITS區(qū)域序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆測序與比對，可有效鑒定根結(jié)線蟲種類[18-20]。從九葉青花椒根部分離的線蟲經(jīng)rDNA-ITS片段比對以及特異性條帶擴(kuò)增鑒定為南方根結(jié)線蟲M.incognita。本研究通過對九葉青花椒根結(jié)線蟲進(jìn)行雌蟲和2齡幼蟲的形態(tài)學(xué)鑒定和成熟雌蟲的會陰花紋鑒定，以及雌蟲酯酶同工酶分析和rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)合特異性擴(kuò)增條帶，結(jié)果表明侵染九葉青花椒的根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲M.incognita。本試驗(yàn)在鑒定病原過程中，通過綜合形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)等鑒定方法，有效避免因鑒定方法單一而產(chǎn)生誤差，做到準(zhǔn)確、有效的分類[21]。這是我國首次報(bào)道由南方根結(jié)線蟲M.incognita引起九葉青花椒根結(jié)線蟲病害。

九葉青花椒屬于多年生樹種，3～4年進(jìn)入盛產(chǎn)期，掛果期可延續(xù)至15年以上，生長壽命長達(dá)20～30年，故與常規(guī)農(nóng)作物的根結(jié)線蟲病害防治工作相比，根結(jié)線蟲病害的防治工作具有長期性與持續(xù)性的特點(diǎn)，因此需結(jié)合不同地理?xiàng)l件與九葉青花椒生長期采取相應(yīng)措施。

在進(jìn)行育苗工作時，最好在無病區(qū)育苗，如若在發(fā)病區(qū)，可在育苗時進(jìn)行育苗土預(yù)處理，可用石灰粉與表層土、腐熟有機(jī)肥進(jìn)行攪拌混均，通過曝曬減少初侵染源。移栽幼苗時，注意檢查根部有無根結(jié)，選擇無病苗造林，同時在選擇造林地時最好不要選擇有根結(jié)線蟲的地塊。一旦發(fā)現(xiàn)病株，立刻就地銷毀，防止病情擴(kuò)散。如若有根結(jié)線蟲，可對種植穴施用噻唑膦等殺線蟲劑進(jìn)行土壤消毒。對已感染根結(jié)線蟲病的九葉青花椒林地，可通過使用生防真菌與生防細(xì)菌進(jìn)行生物防治，減少土壤中根結(jié)線蟲數(shù)量[22-24]，并施用土壤修復(fù)劑，如碳酸氧氨與生石灰等堿性肥料，改善土壤條件，增加根際土壤有益微生物的數(shù)量以及植物根系的活力，從而達(dá)到有效防治根結(jié)線蟲病的目的。

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（責(zé)任編輯： 楊明麗）