李賓賓 余乃通 楊毅

摘要 菌毛裝配蛋白（Flp pilus assembly protein， PAP）是一種分泌蛋白，參與細菌菌毛的組裝，表達量高。本研究以感染柑橘黃龍病的海南瓊海市綠橙葉片為材料提取總DNA，用其菌毛裝配蛋白基因（PAP）的特異引物進行PCR擴增，獲得該基因的目的片段，序列分析表明海南瓊海柑橘黃龍病菌PAP基因與柑橘黃龍病菌亞洲種 （GenBank登錄號：CP001677.5） PAP基因序列一致。功能預(yù)測表明它含有兩個與分泌功能相關(guān)的CpaC 和Secretin結(jié)構(gòu)域。PCR產(chǎn)物通過EcoRⅤ和XhoⅠ雙酶切構(gòu)建重組載體pET32a-PAP。將pET32a-PAP載體轉(zhuǎn)化BL21（DE3）大腸桿菌，經(jīng)終濃度為1 mmoL/L IPTG誘導(dǎo)，目的蛋白主要以包涵體形式表達。目的蛋白經(jīng)Ni2+-NTA層析柱純化，并作為抗原腹腔免疫小白鼠，獲得效價在1∶500～1∶1 000的多克隆抗血清。Western blot分析表明，PAP多克隆抗血清特異性強;以田間樣品總蛋白做抗原時，能特異性檢測染病樣品。本研究為PAP蛋白功能研究和開發(fā)柑橘黃龍病菌的蛋白檢測產(chǎn)品提供研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 柑橘黃龍病; 基因表達; PAP蛋白; 抗血清制備

中圖分類號： S 436.66 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018367

Abstract Flp pilus assembly protein （PAP） is a secreted protein involved in the assembly of bacterial pili with high-level expression. The total DNA was extracted from the HLB-infected green orange leaves collected from Qionghai city， Hainan province， China. The target fragment of PAP gene was obtained by PCR amplification with specific primers. Sequence analysis showed that the PAP gene is identical with the PAP gene of the Candidatus Liberibacter asiaticus （GenBank accession number： CP001677.5）. Function prediction of PAP indicated that it contains two domains associated with secretory function， CpaC and Secretin. PCR products were digested by EcoRⅤ and XhoⅠ restriction enzyme and cloned into vector pET32a. The recombinant pET32a-PAP vector was transformed into Escherichia coli BL21（DE3） and PAP was expressed in the form of inclusion bodies under induction by 1 mmoL/L IPTG. The PAP fusion protein was purified by Ni2+-NTA column and used as an antigen. The mice were immunized intraperitoneally to obtain polyclonal antiserum and the titer was 1∶500-1∶1 000. Western blotting further analysis showed that PAP polyclonal antiserum was specific to PAP protein， which is applicable to field samples detection by ELISA. This study provides a research basis for the function study of PAP protein and the development of protein detection products for HLB.

Key words citrus Huanglongbing; gene expression; PAP protein; antiserum preparation

柑橘黃龍病citrus Huanglongbing （HLB）是柑橘類作物一種毀滅性病害，嚴重威脅著世界各地柑橘類作物的生產(chǎn)[1-2]。目前該病害已相繼在亞洲、非洲、大洋洲和美洲的50多個國家和地區(qū)報道，給柑橘產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1， 3]。中國19個柑橘主產(chǎn)區(qū)已有11個遭受到HLB危害[4]。近年來，隨著海南綠橙等柑橘類產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，柑橘黃龍病也隨之而來并快速傳播[5]。柑橘黃龍病的病原是一種專性寄生于植物韌皮部的革蘭氏陰性菌，屬韌皮部桿菌屬Candidatus Liberibacter，主要由亞洲柑橘木虱Diaphorina citri和非洲柑橘木虱Trioza erytreae傳播[6]。目前已報道的有3個種，即亞洲種Candidatus Liberibacter asiaticus、非洲種Candidatus Liberibacter africanus和美洲種Candidatus Liberibacter americanus[7]。

細菌分泌蛋白在其侵染宿主，引起宿主病變等方面起到重要作用[8-9]。革蘭氏陰性菌含有8個不同類型 （typesⅠ～ typesⅧ） 的蛋白分泌系統(tǒng)[11]，柑橘黃龍病菌含有完整的類型Ⅰ蛋白分泌系統(tǒng)和不完整的類型Ⅲ和類型Ⅳ蛋白分泌系統(tǒng)[12]。

前期，我們從感染HLB的海南綠橙中篩選出表達量較高的兩個分泌蛋白，其中PAP蛋白（Flp pilus assembly protein）與菌毛組裝有關(guān)[13]。本研究從感染HLB的海南綠橙中擴增出PAP蛋白基因，序列分析表明，PAP基因與柑橘黃龍病菌亞洲種（GenBank登錄號：CP001677.5）的PAP基因序列一致[14]。對該蛋白進行原核表達及抗血清制備，得到了特異性強的PAP抗血清，工作效價在1∶500～1∶1 000之間。以田間樣品總蛋白做抗原時，能特異性檢測染病樣品。本研究制備的PAP多抗血清為PAP蛋白的功能研究和開發(fā)柑橘黃龍病菌的蛋白檢測產(chǎn)品提供重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

感染柑橘黃龍病的綠橙葉片采自海南省瓊海市，-80℃保存;pET32a載體由本實驗室保存;Escherichia coli BL21 （DE3）菌株購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;EcoRⅤ和XhoⅠ購自大連寶生物公司;HSTM MIX購自東盛生物公司;植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;BCIP/NBT底物顯色試劑盒、氨芐青霉素（ampicillin）、isopropyl β-D-thiogalactoside （IPTG）、丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（tris）、植物蛋白提取試劑盒購自Solarbio公司;十二烷基硫酸鈉（SDS）、甘氨酸、考馬斯亮藍R-250均購自海南愛斯科坦生物公司;PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自O(shè)mega公司;堿性磷酸酯酶（AP）標記山羊抗小鼠IgG購自Biosharp生物公司;辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠IgG購自碧云天生物技術(shù)公司;其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)柑橘黃龍病菌PAP分泌蛋白基因（GenBank登錄號：CP001677.5）編碼區(qū)核苷酸序列和pET32a載體多克隆酶切位點設(shè)計一對特異性引物，PAP-F （5′-CCG GAT ATC TTG CAT CGT AAG CGC CAA AGA G-3′，下劃線為EcoRⅤ酶切位點）和PAP-R （5′-CCG CTC GAG TCC TGA CGG GAG GAG AGG AGG-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點），由深圳華大基因股份有限公司（BGI）合成。

1.2.2 總DNA的提取及PAP基因的克隆

以感染HLB的綠橙葉片為材料，參照天根植物基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取總DNA，用引物PAP-F和 PAP-R進行PCR擴增。PCR擴增體系為：DNA模板2 μL，正反引物各 2 μL（10 μmol/L），dNTPs 4 μL，5×Taq Buffer 10 μL，Taq DNA polymerase 1 μL，加ddH2O到50 μL。PCR程序為：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 40 s，共35個循環(huán);72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 pET32a-PAP表達載體的構(gòu)建

利用Omega公司的膠回收試劑盒對PAP基因片段進行回收，將回收的PAP基因產(chǎn)物和pET32a載體同時進行EcoRⅤ和XhoⅠ雙酶切，經(jīng)T4 DNA連接酶將PAP基因連接到pET32a載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α菌株，涂布于含50 μg/mL氨芐（Amp）的固體LB平板上，37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)進行抗性篩選。挑取平板上的單克隆菌落，利用PAP-F和 PAP-R引物進行菌液PCR鑒定，隨機選取3個片段大小正確的單克隆菌落送往賽默飛世爾科技（中國）有限公司進行雙向測序。對測序正確的單克隆菌落提取重組載體，進行雙酶切驗證。將經(jīng)過測序和雙酶切驗證的重組載體命名為pET32a-PAP。

1.2.4 PAP蛋白的誘導(dǎo)表達及可溶性分析

對測序正確的重組載體轉(zhuǎn)化E. coli BL21 （DE3）菌株，挑取單克隆菌落接種到液體LB培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp），37℃于200 r/min培養(yǎng)過夜。以1∶50的比例將過夜培養(yǎng)的菌液接種到150 mL液體LB培養(yǎng)基中（含100 μg/mL Amp），37℃，200 r/min條件下培養(yǎng)，待菌液OD600達到0.6～1.0，加入IPTG使其終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。12 000 r/min離心5 min，沉淀溶于15 mL的1×PBS緩沖液中，超聲波破碎20 min（連續(xù)循環(huán)工作4 s，停止8 s）;12 000 r/min離心5 min，將沉淀溶于含8 mol/L尿素的15 mL Lysis buffer中，然后分別取上清和溶解的沉淀10 μL與等量體積的2×SDS loading buffer混合，100℃煮沸10 min，進行12% SDS-PAGE凝膠電泳（90 V， 2 h）。

1.2.5 融合蛋白的純化

用含8 mol/L尿素的15 mL Lysis buffer溶解超聲波破碎后的沉淀，8 000 r/min離心除去不溶性物質(zhì)，上清過0.45 μm濾膜，然后通過Ni2+-NTA親和層析柱進行純化，經(jīng)washing buffer溶液洗去雜蛋白后，用不同濃度的咪唑（50、100、150、200， 250 mmol/L）洗脫液進行洗脫，進行12% SDS-PAGE凝膠電泳檢測。將純化后的蛋白于-20℃保存。

1.2.6 抗血清的制備

取純化后溶于150 mmol/L咪唑的PAP蛋白溶液20 μL與80 μL 1×PBS緩沖液混合，再與100 μL弗氏不完全佐劑混勻，腹腔免疫小白鼠1次;而后每隔7 d腹腔免疫小白鼠1次，共4次（使用弗氏完全佐劑）。最后1次免疫4 d后，對小白鼠進行眼球取血，室溫放置30 min后，于4℃靜置過夜。5 000 r/min 離心10 min，取上層血清，分裝后于-80℃保存。同時，使用1×PBS緩沖液作為對照免疫小白鼠，即對照血清。

1.2.7 抗體效價檢測及特異性檢測

使用間接ELISA法測定PAP多抗血清的效價[15]。將獲得PAP多抗血清分別按1∶500、1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶50 000、1∶100 000的比例進行稀釋。將純化后的PAP蛋白（用包被液1∶1 000稀釋）100 μL加入到96孔板中，37℃孵育2 h;1×PBST緩沖液洗滌3次，加入200 μL的1% BSA封閉液，37℃封閉2 h;重復(fù)洗滌3次，加入100 μL稀釋后的血清，37℃孵育1 h;重復(fù)洗滌3次后加入100 μL HRP標記的羊抗小鼠IgG （1∶3 000），37℃孵育30 min;重復(fù)洗滌3次，隨后加入100 μL TMB底物顯色液，避光條件顯色15 min，最后加入50 μL的濃鹽酸終止反應(yīng)，使用酶標儀測定OD450。

取純化后溶于150 mmol/L咪唑的PAP蛋白溶液20 μL與等量體積的2×SDS loading buffer混合，100℃煮沸10 min變性，進行12%SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白凝膠和硝酸纖維素膜（NC膜）預(yù)先用轉(zhuǎn)膜液浸泡5 min，放入半干轉(zhuǎn)膜儀中，電流1 A轉(zhuǎn)膜25 min。轉(zhuǎn)膜完成后用1×TBST緩沖液清洗NC膜3次;5%脫脂奶粉封閉液進行封閉2 h;1×TBST緩沖液清洗3次后置于PAP多抗血清（1∶1 000）孵育1 h;1×TBST緩沖液清洗3次，將其置于堿性磷酸酯酶（AP）標記山羊抗小鼠IgG稀釋液（1∶2 000）孵育30 min;1×TBST緩沖液清洗3次，最后使用BCIP/NBT顯色試劑盒顯色，拍照保存。

采用Solarbio公司植物蛋白提取試劑盒提取感染HLB的綠橙和對照樣品蛋白。將提取的蛋白稀釋1 000倍（1∶1 000）和2 000倍（1∶2 000）作為抗原，以1∶1 000稀釋的PAP多抗血清為一抗，按照上述方法，進行ELISA檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAP基因的克隆及其序列分析

以感染HLB的綠橙總DNA為模板進行PCR擴增，得到大小為1 400 bp左右，與目的基因大小一致的DNA條帶（圖1a）。測序結(jié)果經(jīng)NCBI BLASTn分析表明，該基因為柑橘黃龍病菌的PAP分泌蛋白基因，與Duan等[14]報道的柑橘黃龍病菌亞洲種（GenBank登錄號：CP001677.5）的PAP基因序列一致，大小為1 425 bp，編碼474個氨基酸，分子量大小為51.76 kD。

氨基酸比對分析表明，本研究獲得的PAP蛋白與柑橘黃龍病菌亞洲種的PAP蛋白同源性在99.5%～100%;與番茄、辣椒和胡蘿卜等分離的黃龍病新種（Candidatus Liberibacter solanacearum）的PAP蛋白同源性在68.4%～70.1%;與柑橘黃龍病菌非洲種的PAP蛋白同源性在66.6%;與柑橘黃龍病菌美洲種的PAP蛋白同源性在45.8%～46.8%（圖2）。NCBI保守結(jié)構(gòu)域（NCBI conserved domain）預(yù)測分析表明，本研究獲得的PAP蛋白含有2個高度可信的與分泌功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，即CpaC結(jié)構(gòu)域（AA22-474）和Secretin結(jié)構(gòu)域（AA262-419）;另外，該蛋白還預(yù)測含有2個可能結(jié)構(gòu)域（可信度不高，有待進一步確認），即type_II_gsp結(jié)構(gòu)域（AA194-428）和IV結(jié)構(gòu)域（AA232-420）（圖3）。

2.2 原核表達載體的構(gòu)建

測序結(jié)果表明，3個單克隆菌中的PAP基因插入片段大小正確，堿基無缺失、突變發(fā)生，且編碼框無移位。雙酶切驗證如圖1b所示，特異性獲得酶切后的PAP基因和pET32a載體片段。將經(jīng)過測序和雙酶切驗證的重組載體命名為pET32a-PAP，作為后續(xù)原核表達的重組質(zhì)粒。

2.3 PAP蛋白的原核表達及可溶性分析

將pET32a-PAP重組載體轉(zhuǎn)化BL21 （DE3）表達菌，挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆菌落接種到含氨芐的LB液體培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)表達，分離上清和沉淀進行可溶性分析。12% SDS-PAGE凝膠電泳表明，與未誘導(dǎo)的重組菌相比，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h后的重組菌在分子量大小約70 kD處，出現(xiàn)一條清晰的蛋白條帶（圖4a），與預(yù)測的PAP融合蛋白70.73 kD大小基本一致，即PAP融合蛋白。可溶性分析結(jié)果表明，PAP目的蛋白主要以沉淀形式（包涵體）表達（圖4b）。

2.4 融合蛋白純化

由于PAP融合蛋白含有His標簽，可經(jīng)過Ni2+-NTA親和層析柱純化。將含有PAP融合蛋白的包涵體沉淀溶解，用不同咪唑濃度的洗脫液洗脫純化，最后用SDS×PAGE分析該蛋白在不同咪唑濃度洗脫液中的分布情況。結(jié)果如圖5所示，經(jīng)50 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫后，Ni2+-NTA親和層析柱上的雜蛋白可除去大部分;再經(jīng)100 mmol/L和150 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫后，大部分PAP融合蛋白從Ni2+-NTA親和層析柱中洗脫下來，而在200 mmol/L和250 mmol/L咪唑的洗脫液中分布很少。由此可見，經(jīng)不同咪唑濃度的洗脫液洗脫后，PAP融合蛋白主要分布在100 mmol/L和150 mmol/L咪唑的洗脫液中，且在150 mmol/L咪唑的洗脫液中濃度更高，于-20℃保存，備用。

2.5 PAP多抗血清效價及特異性

以純化后的PAP融合蛋白（1∶1 000稀釋）為抗原，對不同PAP多抗血清進行稀釋，通過ELISA方法對PAP多抗血清進行效價測定。結(jié)果（圖6）表明，與對照血清相比，PAP多抗血清在稀釋500倍和1 000倍時，PAP多抗血清呈明顯的陽性反應(yīng)（判斷標準為PAP PcAb的OD450/PBS PcAb的OD450 >2.1）;而PAP多抗血清在稀釋5 000倍以上均無陽性反應(yīng)。Western blot結(jié)果分析表明，PAP多抗血清能與純化后的融合蛋白起特異性反應(yīng)，無其他明顯雜帶（圖7）。田間樣品ELISA檢測結(jié)果顯示，PAP多抗血清能特異性區(qū)分染病綠橙和對照樣品（表1）。

3 討論

前期，Li等通過PCR，qPCR和RT-qPCR的方法從感染HLB的海南綠橙樣品中篩選出2個表達量高的柑橘黃龍病菌分泌蛋白，408和PAP。這兩個蛋白均參與菌毛的組裝[13]。將PAP蛋白基因構(gòu)建到GV1300植物雙向表達載體，通過農(nóng)桿菌注射煙草進行瞬時表達，共聚焦顯微鏡觀察表明，在煙草保衛(wèi)細胞的微纖維絲觀察到綠色熒光，說明PAP蛋白可能與調(diào)控保衛(wèi)細胞的宿主蛋白相互作用，幫助病原菌穿過保衛(wèi)細胞以達到入侵植株的目的。但是，柑橘黃龍病菌具體的侵染過程和機理有待進一步研究。

目前，柑橘黃龍病的有效檢測方法包括PCR[16]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）[17]、熒光定量PCR[18]、重組酶聚合酶擴增方法（RPA）[19]等診斷技術(shù)。雖然柑橘黃龍病菌相關(guān)蛋白基因的單克隆和多克隆制備已有報道[12， 20-22]，但是目前尚無商業(yè)化的蛋白檢測產(chǎn)品。PAP蛋白是柑橘黃龍病菌的分泌蛋白，是菌毛蛋白的重要組成成分，它的含量是病菌含量的幾千甚至是幾萬倍以上。本研究使用該蛋白進行抗體制備，不但豐富了制備HLB蛋白檢測產(chǎn)品的選擇，同時使用該蛋白制備的單克隆抗體或多克隆抗體產(chǎn)品具有更高的效價和靈敏度。

柑橘黃龍病病菌根據(jù)病原的傳播媒介、序列特征和熱敏性等可分為亞洲種、非洲種和美洲種。根據(jù)PAP蛋白基因的序列分析，感染海南綠橙的柑橘黃龍病菌為亞洲種，與我國其他地區(qū)柑橘類作物上報道的柑橘黃龍病菌屬于一個種。因此，使用本研究制備的抗體不但能用于海南綠橙黃龍病的檢測，也可用于我國其他柑橘類黃龍病的檢測。

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（責任編輯： 楊明麗）