馮程程 劉新剛 董豐收

摘要 利用QuEChERS技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測(cè)5種動(dòng)物源食品（雞肉、雞蛋、豬肝、牛奶、豬肉）中氟蟲(chóng)腈及其3個(gè)代謝物殘留量。樣品用乙腈提取，經(jīng)低溫處理，多壁碳納米管（MWCNTs）、弗羅里硅土（Florisil）和C18分散固相萃?。╠-SPE）凈化，外標(biāo)法定量。在不同濃度的加標(biāo)水平下，氟蟲(chóng)腈及其代謝物在5種動(dòng)物源食品中的平均回收率為72.1%～113.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.9%～17.6%，檢出限LOD在0.73～1.94 μg/kg范圍內(nèi)，定量限LOQ在5～10 μg/kg范圍內(nèi)。該方法具有簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適用于動(dòng)物源食品中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的快速篩查和定量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 農(nóng)藥殘留; 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜; 動(dòng)物源食品; 氟蟲(chóng)腈

中圖分類(lèi)號(hào)： S 481.8 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018235

Abstract The QuEChERS technique combined with ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was used to detect the residues of fipronil and its three metabolites in five foods of animal origin including chicken， milk， eggs， pork liver and pork. The samples were extracted with acetonitrile， and then experienced low-temperature treatment， d-SPE purification of MWCNTs， Florisil and C18， BEH C18 by using the external standard method. At different concentrations， the average recoveries of fipronil and its metabolites in the five foods were in the range of 72.1%-113.8%， with RSD in the range of 1.9%-17.6%. The LOD was in the range of 0.73-1.94 μg/kg， and LOQ in the range of 5-10 μg/kg. This method is simple， sensitive and accurate. It is suitable for rapid screening and quantitative detection of fipronil and its metabolites in the foods animal origin.

Key words pesticide residue; UPLC-MS/MS; food of animal origin; fipronil

氟蟲(chóng)腈（fipronil）是世界上首個(gè)苯基吡唑類(lèi)殺蟲(chóng)劑，由法國(guó)Rhone-Poulenc公司開(kāi)發(fā)[1]，化學(xué)名稱(chēng)為5-氨基-1-三氟甲基-4-三氟甲基亞磺?；吝?3-腈。分子式為：C12H4Cl2F6N4OS。氟蟲(chóng)腈主要作用是與γ-氨基丁酸受體（GABA）結(jié)合，抑制氯離子通道，破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)最終達(dá)到殺滅昆蟲(chóng)的目的[2]。由于氟蟲(chóng)腈是一種化學(xué)性質(zhì)活潑化合物，在其施用后，經(jīng)過(guò)水解、光解等作用，會(huì)生成3種代謝產(chǎn)物：氟蟲(chóng)腈砜（MB46136）、氟蟲(chóng)腈硫醚（MB45950）和氟甲腈（MB46513）。對(duì)其代謝物毒性的研究表明：這三者的毒性要高于氟蟲(chóng)腈原藥[3]。

隨著人們對(duì)畜產(chǎn)品肉、蛋、奶等的需求量逐漸增加以及對(duì)食品安全的重視程度的不斷提高，國(guó)家食品藥品監(jiān)督局和農(nóng)業(yè)部相關(guān)部門(mén)對(duì)畜產(chǎn)品質(zhì)量也提出了更高的要求。農(nóng)藥殘留易造成飼養(yǎng)環(huán)境污染，威脅畜產(chǎn)品的質(zhì)量安全。因此開(kāi)發(fā)快速、可靠、高靈敏度的農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)是十分重要的。

關(guān)于氟蟲(chóng)腈殘留檢測(cè)最常見(jiàn)的方法是氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)法（GC-ECD）[4]、液相色譜法（LC）[5]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[6]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）及固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（SPME-GC-MS）[7]等。

QuEChERS方法于2003年由Michelangelo等提出[8]。QuEChERS方法具有操作簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間、對(duì)環(huán)境污染小、處理步驟少、分析效率高等優(yōu)點(diǎn)，在食品、環(huán)境、生物等多種領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，適用于農(nóng)藥多殘留檢測(cè)[9-10]。QuEChERS方法還可根據(jù)不同的吸附劑種類(lèi)匹配不同的樣品基質(zhì)來(lái)消除基質(zhì)干擾。最近幾年，不斷涌現(xiàn)出一些新型的吸附劑如碳納米管、生物吸附劑等。其中多壁碳納米管（MWCNTs）因其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為內(nèi)部中空的納米級(jí)管，較大的比表面積和表面的疏水基團(tuán)使其具有較強(qiáng)的吸附和去除色素的能力，被越來(lái)越多地應(yīng)用于樣品前處理過(guò)程中[11]。

本論文通過(guò)對(duì)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法以及前處理方法的優(yōu)化，建立了QuEChERS技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)5種動(dòng)物源食品（雞肉、雞蛋、豬肝、牛奶、豬肉）中氟蟲(chóng)腈及其3個(gè)代謝物的殘留的方法，并將此方法應(yīng)用到來(lái)自14個(gè)省份的420個(gè)樣品的檢測(cè)中。通過(guò)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，為產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

無(wú)水MgSO4、NaCl，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司;色譜純乙腈，Sigma-Aldrich， Germany;超純水，由Milli-Q超純水儀（Bedford， MA， USA）制備;MWCNTs、florisil、C18、氟甲腈標(biāo)準(zhǔn)品 （99.7%）、氟蟲(chóng)腈砜標(biāo)準(zhǔn)品（99.7%）、氟蟲(chóng)腈硫醚標(biāo)準(zhǔn)品（99.7%）由以色列馬克西姆化學(xué)公司提供;0.22 μm濾膜，Agela Technologies，天津;超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Acquity UPLC-TQD），Waters公司;KQ-超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;Milli-Q超純水儀，美國(guó)Merck-Millipore公司;X1R高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司;氮吹儀，北京八方世紀(jì)科技有限公司。

1.2 樣品前處理方法

用萬(wàn)分之一天平稱(chēng)取氟蟲(chóng)腈（99.7%）、氟甲腈（99.7%）、氟蟲(chóng)腈硫醚（99.7%）和氟蟲(chóng)腈砜（99.7%）標(biāo)準(zhǔn)品各0.100 3 g，以色譜純乙腈作為溶劑定容到100 mL，配制濃度為100 mg/L母液，轉(zhuǎn)入棕色瓶置于-4℃冰箱保存。同時(shí)采用梯度稀釋法配制0.5、1、2、10 mg/L和20 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

準(zhǔn)確稱(chēng)取雞肉、雞蛋、牛奶、豬肉和豬肝各5.0 g樣品（精確至0.1 g）于50 mL聚四氟乙烯離心管中，分別加入0.1 mL濃度為1、2和20 mg/L（牛奶、雞蛋、豬肝）或0.5、1和10 mg/L（雞肉和豬肉）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后加入10 mL乙腈作為提取液，渦旋振蕩1 min，室溫下靜置30 min。然后加入3 g NaCl 和2 g 無(wú)水MgSO4，渦旋振蕩10 min， 以4 000 r/min離心3 min，取上清液1 mL，置于裝有凈化劑[50 mg florisil（C18）和150 mg無(wú)水MgSO4或10 mg MWCNTs （MW<8 nm）]的5 mL離心管，渦旋3 min，以4 000 r/min離心3 min。用無(wú)菌注射器抽取上清液，置于離心管中，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜于進(jìn)樣小瓶中，用于進(jìn)樣。

1.3 液相色譜質(zhì)譜條件

超高效液相色譜的構(gòu)成為：具有色譜柱的加熱器、樣品管理器和雙通道溶劑管理器。Waters UPLC 色譜柱（Acquity BEH C18色譜柱 1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫控制在45℃，流動(dòng)相為乙腈和水。流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。

三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀配備的是電噴霧離子源，采用負(fù)離子ESI-模式;MRM多反應(yīng)離子檢測(cè)模式，去溶劑氣和錐孔氣都是高純氮?dú)?，毛?xì)管電壓為3.0 KV;去溶劑溫度為350℃。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、準(zhǔn)確度和精密度

稱(chēng)取一定量的氟蟲(chóng)腈及其3個(gè)代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配置成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并依次稀釋成1 000.0、500.0、100.0、50.0、10.0、5.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2和1.3的條件進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量，以氟蟲(chóng)腈及其3個(gè)代謝物的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

在5～200 μg/kg范圍內(nèi)分別對(duì)氟蟲(chóng)腈及其3個(gè)代謝物進(jìn)行3個(gè)濃度的添加回收試驗(yàn)，牛奶、雞蛋和豬肝的添加濃度分別為10、20與200 μg/kg，雞肉和豬肉分別為5、10和100 μg/kg。且每個(gè)添加水平重復(fù)5次，用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)驗(yàn)證方法的精密度（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)條件的優(yōu)化

氟蟲(chóng)腈在高效液相串聯(lián)質(zhì)譜上正負(fù)離子模式結(jié)果表明：氟蟲(chóng)腈及其3個(gè)代謝物在ESI-模式和合適的錐孔電壓和碰撞能量下具有明顯的特征離子峰[M-H]-，選擇2個(gè)碎片離子峰度和碎片離子數(shù)量都較大的離子作為定性離子和定量離子。調(diào)節(jié)碰撞能量，獲得進(jìn)一步優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)（表1）。

2.2 凈化劑的選擇

因動(dòng)物源食品基質(zhì)復(fù)雜，提取液中含有較多的脂肪和其他的復(fù)雜基質(zhì)，如果直接進(jìn)樣，可能會(huì)導(dǎo)致色譜柱中殘留比較多的脂肪和雜質(zhì)，影響色譜柱的壽命，從而導(dǎo)致其分離效率的降低。再者，質(zhì)譜部件的錐孔處容易堆積部分脂肪和雜質(zhì)，致使儀器的靈敏度下降，重復(fù)性降低。C18對(duì)去除樣品中非極性物質(zhì)和中等極性物質(zhì)有良好的作用[12]，而弗羅里硅土（florisil）主要是用來(lái)去除樣品中油脂類(lèi)物質(zhì)[13]，多壁碳納米管一般不成束，具有不同大小和尺寸的孔徑結(jié)構(gòu)，碳納米管的中空納米結(jié)構(gòu)及較大的比表面積使其具有較多的吸附位點(diǎn)和較強(qiáng)的吸附力[14]。因此本研究中考察了弗羅里硅土（florisil）、C18和多壁碳納米管（MWCNTs）3種凈化劑對(duì)其凈化的效果。

各種凈化劑在5種動(dòng)物源食品中的凈化效果如圖2所示，當(dāng)雞肉和雞蛋選擇弗羅里硅土，豬肉、牛奶和豬肝選擇MWCNTs時(shí)能夠很好地祛除提取液中的雜質(zhì)并能取得比較好的凈化效果。

2.3 分析方法的線(xiàn)性和基質(zhì)效應(yīng)

2.3.1 分析方法的線(xiàn)性

結(jié)果表明：氟蟲(chóng)腈及其3個(gè)代謝物在5～1 000 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。氟蟲(chóng)腈的線(xiàn)性方程：y=33.392x+1 159.1，R2=0.993 3;氟甲腈的線(xiàn)性方程為：y=28.584x+1 138.7，R2=0.990 8;氟蟲(chóng)腈硫醚的線(xiàn)性方程為：y=26.096x+756.88，R2=0.991 1;氟蟲(chóng)腈砜的線(xiàn)性方程為：y=63.57x+1 405.6，R2=0.995 1。

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)

分別對(duì)豬肉、雞蛋、雞肉、牛奶和豬肝空白基質(zhì)進(jìn)行樣品前處理，得到空白基質(zhì)溶液。用空白基質(zhì)溶液和乙腈分別配制濃度為10、20、50、100、200和1 000 μg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），對(duì)濃度（x）繪制做出基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。按如下公式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)：ME%=（B-A）/B×100%，其中B為溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率，A為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率。當(dāng)ME%<0時(shí)，為基質(zhì)的增強(qiáng)效應(yīng)，當(dāng)ME%>0時(shí)，為基質(zhì)的抑制效應(yīng)[15]。結(jié)果見(jiàn)表2，表明化合物對(duì)動(dòng)物基質(zhì)均有較大的基質(zhì)效應(yīng)，為保證檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性，樣品分析采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正。

2.4 分析方法的準(zhǔn)確度、精密度及靈敏度

2.4.1 分析方法的準(zhǔn)確度和精密度

氟蟲(chóng)腈及其3個(gè)主要代謝物在5種動(dòng)物源食品中的平均回收率為72.1%～113.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.9%～17.6%。結(jié)果符合農(nóng)藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)（表3）。添加回收試驗(yàn)和空白樣品的色譜圖見(jiàn)圖3。

2.4.2 分析方法的靈敏度

用空白樣品制取濃度依次為10、20、50、100和200 μg/L的基質(zhì)加標(biāo)樣品?；赨PLC-MS/MS條件，各化合物的定量離子均能在信噪比的10倍以上，該方法的靈敏度用噪音信號(hào)的3倍來(lái)表示，得出最低檢測(cè)限濃度LOD為0.73～1.94 μg/kg，定量限LOQ為5～10 μg/kg。國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）規(guī)定：氟蟲(chóng)腈及其代謝物在牛奶、豬肝和雞蛋中的限量值為0.02 mg/kg，在雞肉和豬肉的限量值為0.01 mg/kg。表4中匯總了線(xiàn)性方程、決定系數(shù)、線(xiàn)性范圍及檢出限。氟蟲(chóng)腈及其代謝物在10～200 μg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，決定系數(shù)（R2）大于0.990 1。

3 方法的應(yīng)用

試驗(yàn)所用的樣品來(lái)自河南、北京、新疆、山東、內(nèi)蒙古、四川、浙江、江蘇、寧夏、海南、河北、湖北、云南、黑龍江和廣州14個(gè)省份共420個(gè)樣品。對(duì)這420個(gè)動(dòng)物源食品進(jìn)行前處理后用于氟蟲(chóng)腈殘留分析。從氟蟲(chóng)腈檢測(cè)結(jié)果（表5）看出，在所有檢測(cè)的動(dòng)物源食品中，都沒(méi)有檢出氟蟲(chóng)腈。

4 結(jié)論

本文建立了QuEChERS技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)5種動(dòng)物源食品中氟蟲(chóng)腈及其3個(gè)代謝物殘留的分析方法。氟蟲(chóng)腈及3個(gè)代謝產(chǎn)物在5～1 000 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，氟蟲(chóng)腈的線(xiàn)性方程：y=33.392x+1 159.1，R2=0.993 3;氟甲腈的線(xiàn)性方程為：y=28.584x+1 138.7，R2=0.990 8;氟蟲(chóng)腈硫醚的線(xiàn)性方程為：y=26.096x+756.88，R2=0.991 1;氟蟲(chóng)腈砜的線(xiàn)性方程為：y=63.57x+1 405.6，R2=0.995 1。氟蟲(chóng)腈及其代謝物在5種動(dòng)物源食品中的平均回收率為72.1%～113.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.9%～17.6%，最低檢測(cè)濃度LOQ為5～10 μg/kg。結(jié)果表明方法的靈敏度和精確度均符合實(shí)際樣品的檢測(cè)要求?？捎米鲃?dòng)物源食品中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的殘留檢測(cè)。

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（責(zé)任編輯： 田 喆）