鄭亞強 胡惠芬 付玉飛

摘要 草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda （J.E.Smith）是2019年入侵我國的一種遷飛性害蟲，已成為嚴(yán)重影響我國玉米生產(chǎn)的重要害蟲。目前國內(nèi)關(guān)于草地貪夜蛾昆蟲病原真菌的研究報道很少。2019年6月，在云南省曲靖市沾益縣安東村玉米田調(diào)查發(fā)現(xiàn)了被蟲生真菌感染的草地貪夜蛾幼蟲。經(jīng)室內(nèi)分離培養(yǎng)，結(jié)合形態(tài)和ITS序列相似性分析鑒定確認(rèn)，感染草地貪夜蛾幼蟲病原性真菌為萊氏綠僵菌Metarhizium rileyi，編號為ZYSP190701菌株。調(diào)查表明，2019年7月17日田間草地貪夜蛾的萊氏綠僵菌感染率為15.46%±2.52%，8月2日感染率達(dá)29.83%±13.71%。用萊氏綠僵菌ZYSP190701菌株1×108個/mL孢子濃度接種草地貪夜蛾3齡幼蟲后第7天時草地貪夜蛾的感染死亡率高達(dá)100%。上述結(jié)果表明，萊氏綠僵菌ZYSP190701對草地貪夜蛾有良好的生防潛力，具有草地貪夜蛾生防菌劑開發(fā)應(yīng)用的前景。

關(guān)鍵詞 草地貪夜蛾; 萊氏綠僵菌; 昆蟲病原真菌; 生防菌劑

中圖分類號： S 435.132 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019399

Abstract Spodoptera frugiperda （J.E.Smith） is an outbreak invasive pest， especially for maize. To date， little information about entomopathogenic fungi of Spodoptera frugiperda is available in China. In this study， fungi infected S.frugiperda larvae were found in Andong village， Zhanyi county， Qujing city， Yunnan province. The fungi were isolated from the infected cadaver of S.frugiperda， and then the species was identified based on the morphological and molecular biology， the virulence of the fungi against the larvae of S.frugiperda was tested. Results showed that this strain was identified as Metarhizium rileyi （No. ZYSP190701）. The infection rate of S.frugiperda was 15.46%±2.52% on 17th， July and 29.83%±13.71% on 2nd， August， respectively. The cumulative mortality of the 3rd instar larvae of S.frugiperda 7 d after immersion inoculation at 1 ×108 conidia/mL was 100%. Our results demonstrated that M.rileyi ZYSP190701 is a promising candidate for S.frugiperda biocontrol in field.

Key words Spodoptera frugiperda; Metarhizium rileyi; entomopathogenic fungi; biological agents

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda （J. E. Smith），又名秋黏蟲，隸屬于鱗翅目Lepidoptera，夜蛾科Noctuidae，是一種原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)的雜食性害蟲，尤其對玉米的危害較為嚴(yán)重[1-3]。自2019年1月在我國云南省普洱市江城縣首次發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾入侵以來[4]，該蟲已蔓延至我國的19個省1 000余個縣，嚴(yán)重為害我國的玉米等作物[5]。目前對于該蟲的防治主要采用化學(xué)防治方法，然而該蟲對農(nóng)藥的抗性較強，加之農(nóng)藥殘留對于人畜的安全隱患，使化學(xué)農(nóng)藥防治受到一定制約[6-7]。自該蟲遷入我國以來，在我國科技工作者積極探究下，已發(fā)現(xiàn)一些昆蟲天敵對草地貪夜蛾具有較好的生物防控能力[8-10]。然而，國內(nèi)關(guān)于該蟲的病原真菌還鮮有報道。

昆蟲病原真菌（entomopathogenic fungi）是一類能感染昆蟲并在其體表或體內(nèi)增殖，使昆蟲發(fā)病甚至死亡的真菌[11]。因其對環(huán)境友好，對害蟲具有持續(xù)的控制能力，不易產(chǎn)生抗藥性，被認(rèn)為是最有可能替代化學(xué)農(nóng)藥的下一代新型生物農(nóng)藥[11]。目前，在農(nóng)林業(yè)害蟲生物防治中，運用較為廣泛的有球孢白僵菌Beauveria bassiana、綠僵菌Metarhizium spp.和玫煙色棒束孢Isaria fumosorosea，全世界以這些真菌開發(fā)和注冊的微生物殺蟲劑有170多種[11-14]。

我國利用蟲生真菌殺蟲劑在防治林業(yè)害蟲馬尾松毛蟲Dendrolimus punctatus和糧食作物害蟲亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis（Guenée）和蝗蟲等方面取得了重要成效[15]。國外一些研究表明，球孢白僵菌B. bassiana，布氏白僵菌B. brongniartii，金龜子綠僵菌M.anisopliae，萊氏綠僵菌M.rileyi對草地貪夜蛾具有良好的生防潛能[16-18]。而國內(nèi)，除程東美等[19]報道白僵菌對草地貪夜蛾具有良好的生防潛力外，尚未見其他相關(guān)研究報道。

萊氏綠僵菌M.rileyi （Farl.） Kepler，S.A. Rehner & Humber，原名萊氏野村菌Nomuraea rileyi （Farl.） Samson[20]，隸屬子囊菌門Ascomycota，麥角菌科Clavicipitaceae，是一種對鱗翅目幼蟲極具生防潛能的蟲生真菌，在適宜的環(huán)境條件下能引起害蟲的病害流行，有效地防治害蟲[21-22]。研究表明，該菌對斜紋夜蛾S.litura、棉鈴蟲Helicoverpa armigera和小菜蛾P(guān)lutella xylostella等多種害蟲具有較好的侵染致病力[23-25]。然而，國內(nèi)尚未見萊氏綠僵菌感染草地貪夜蛾的報道。

本課題組在云南省曲靖市沾益縣玉米種植區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，田間有草地貪夜蛾幼蟲被真菌感染，由此對病原菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)和種類鑒定，為明確該菌株的分類地位和生防潛能，初步測定了該菌株的侵染致病性，擬為開發(fā)真菌殺蟲劑綠色防控草地貪夜蛾提供備選菌株和一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采集地點及調(diào)查方法

試驗地點為云南省曲靖市沾益縣安東村玉米種植區(qū)。于該玉米種植區(qū)選擇5塊玉米田，每塊田5點取樣，每點20株，逐一統(tǒng)計每株玉米上草地貪夜蛾的數(shù)量和罹病蟲量，計算僵蟲率。2019年6月28日首次發(fā)現(xiàn)該地有罹病草地貪夜蛾蟲體，分別于2019年7月17日和8月2日進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查。

1.2 菌株的分離培養(yǎng)

將采集到的罹病草地貪夜蛾蟲體置于5 mL無菌EP管中帶回實驗室，采用劃線法，在薩氏（SDAY）培養(yǎng)基[26]（葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏粉10 g，瓊脂20 g，pH自然）上，于（25±1）℃，L∥D=16 h∥8 h， 相對濕度80%的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，將分生孢子轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。純化的菌株采用SDAY斜面培養(yǎng)基保存于4℃冰箱。經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定，所有分離的菌株形態(tài)特征一致，將其視為同一種菌，并命名為ZYSP190701。

1.3 菌株致病性測定

將分離獲得的菌株ZYSP190701接種于PDA培養(yǎng)基，待其產(chǎn)生大量的分生孢子后（約20 d），用無菌解剖刀刮取培養(yǎng)基表面的分生孢子置于0.02%無菌吐溫80（北京索來寶生物有限公司）中，配制成1×108個/mL孢子懸浮液。挑選大小一致、健康的草地貪夜蛾3齡幼蟲，采用浸漬法進(jìn)行接種。將草地貪夜蛾幼蟲置于孢子懸浮液中浸漬5 s，取出后用滅菌濾紙吸干蟲體表面多余水分。然后將其置于加有玉米葉的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于25℃、L∥D=16 h∥8 h光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。每天定時觀察，并將死亡蟲體在（25±1）℃、 L∥D=16 h∥8 h條件下保濕培養(yǎng)，根據(jù)蟲體是否長出目的菌確定各蟲的死亡原因。設(shè)置3個重復(fù)，每重復(fù)20頭蟲。

1.4 菌落形態(tài)觀察

將分離并純化的真菌分別接于PDA（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，自然pH，蒸餾水1 000 mL）和SDAY培養(yǎng)基上，置于（25±1）℃，L∥D=16 h∥8 h光照培養(yǎng)箱（恒立（中國）實驗室設(shè)備科技有限公司，型號RG300）中培養(yǎng)，于3、7和14 d時，分別測定菌落直徑并觀察菌落形態(tài)特征。

1.5 基因組DNA提取及rDNAITS的PCR擴增

病原菌DNA的提?。簠⒄贞惣嫉萚27]的Chelex100法進(jìn)行。使用無菌解剖刀于固體培養(yǎng)基上挑起綠豆大小菌苔于1.5 mL Eppendorf管中，加入液氮稍加研磨。然后加入0.5 mL 10%（m/V）的Chelex100溶液，渦旋器上振蕩5 s，沸水浴10 min，冷卻至室溫后，12 000 r/min離心15 min。取上清液備用。

rDNAITS的PCR擴增：PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括引物ITS1和ITS4各1 μL，PCR mix 12.5 μL，基因組DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性 1 min，57℃退火2 min，72℃延伸 1 min，32個循環(huán);72℃延伸 5 min。1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物送昆明碩擎生物科技有限公司測序。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)測序結(jié)果，將序列進(jìn)行編輯，去除兩端質(zhì)量不好的堿基，將優(yōu)化好的ITS 序列提交到NCBI網(wǎng)站 （http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），運用BLAST程序進(jìn)行比對。序列經(jīng)BLAST 后下載相似性大于84%的序列及其相關(guān)近緣屬菌株的ITS 序列，用MEGA 6.06 進(jìn)行序列處理，應(yīng)用最大似然法（ML），運行1 000 次bootstrap驗證，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間僵蟲率及室內(nèi)致病性

2019年6月28日在云南省曲靖市沾益縣安東村玉米種植區(qū)首次發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾的罹病蟲體，2019年7月17日和8月2日對草地貪夜蛾的僵蟲率進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查，結(jié)果表明，7月17日時僵蟲率較低，為15.46%±2.52%。8月2日僵蟲率為29.83%±13.71%（圖1）。在田間，被感染的草地貪夜蛾幼蟲一般附著于玉米葉片上或玉米心葉中，罹病蟲體前期僵硬，蟲體發(fā)紅，隨后逐漸長出大量白色菌絲，后期罹病蟲體表面產(chǎn)生大量綠色的孢子粉（圖2a～d）;孢子經(jīng)室內(nèi)分離培養(yǎng)后采用浸漬法回接草地貪夜蛾健康幼蟲，接菌后3～7 d草地貪夜蛾幼蟲死亡，其感染癥狀和形態(tài)特征與田間感染癥狀一致，說明該菌株為草地貪夜蛾的病原真菌。致病性初步測定結(jié)果表明，在1×108個/mL孢子濃度下，接菌后第7天，草地貪夜蛾3齡幼蟲的累積死亡率達(dá)100%。

2.2 病原真菌的形態(tài)學(xué)特征

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（責(zé)任編輯： 楊明麗）