周仲燕 榮伊

摘要：指出了野木瓜總皂苷是一種用于消炎鎮(zhèn)痛的傳統(tǒng)中藥。為了研究野木瓜總皂苷的瞬時(shí)鎮(zhèn)痛效果，選取體外培養(yǎng)成熟的小鼠大腦皮層神經(jīng)元，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄了不同濃度野木瓜總皂苷對(duì)細(xì)胞mEPSC和mIPSC的影響。發(fā)現(xiàn)在瞬時(shí)改變野木瓜總皂苷濃度的情況下，記錄到mEPSC和mIPSC的頻率和幅值均沒(méi)有顯著變化。結(jié)果表明：野木瓜總皂苷在小鼠大腦皮層中的鎮(zhèn)痛效果不是瞬時(shí)產(chǎn)生的。

關(guān)鍵詞：野木瓜總皂苷;傳統(tǒng)中藥;大腦皮層神經(jīng)元

中圖分類號(hào)：R285 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944（2019）20-0147-02

1引言

疼痛是一種讓人感覺(jué)不太好的主觀感受，出現(xiàn)在生活中的方方面面，嚴(yán)重的疼痛會(huì)給人們的身體和心靈帶來(lái)雙重折磨。野木瓜總皂苷是一種常綠藤本植物，生長(zhǎng)于廣東、廣西、貴州等地，根據(jù)中藥典籍記載，稱其根、莖、葉有祛風(fēng)止痛、舒經(jīng)活絡(luò)、化濕和胃等功效，是一種我國(guó)獨(dú)有的傳統(tǒng)中藥。目前市面上已有野木瓜片劑、野木瓜注射液等藥品，主要運(yùn)用于臨床鎮(zhèn)痛、消炎，且效果顯著。葉文博等學(xué)者對(duì)野木瓜注射液進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)大鼠神經(jīng)細(xì)胞的髓鞘和軸突膜有親和力，可以改變髓鞘和軸突的結(jié)構(gòu)，從而阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)，并且進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，引起這一現(xiàn)象的主要成分就是野木瓜皂苷。此外，陳素等學(xué)者對(duì)野木瓜的根莖提取出的野木瓜總皂苷（TSS）進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，TSS在動(dòng)物水平上可以增加熱刺激急性疼痛的閾值并且與阿片受體無(wú)關(guān)，可以減輕醋酸引起的急性內(nèi)臟痛、福爾馬林誘導(dǎo)的急性炎性痛、辣椒素誘導(dǎo)的急性神經(jīng)性疼痛。此外，用10ug/mL的TSS溶液孵育小鼠大腦皮層神經(jīng)元后，發(fā)現(xiàn)其mlPSC的頻率和幅值，抑制性突觸后GABA受體的活性也有增強(qiáng)，并且鎮(zhèn)痛效果至少可以持續(xù)8h。

已有研究表明，給藥60min后，TSS可以通過(guò)增加小鼠大腦皮層神經(jīng)元抑制性突觸的自發(fā)性釋放從而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。那么，在給藥的短時(shí)間內(nèi)是否會(huì)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用目前尚不清楚。此次研究中，主要探究了TSS在小鼠大腦皮層中的瞬時(shí)鎮(zhèn)痛效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSS在短時(shí)間內(nèi)不能引起小鼠大腦皮層神經(jīng)元自發(fā)性抑制性突觸和興奮性突觸反應(yīng)的增強(qiáng)，因此TSS不能對(duì)小鼠大腦皮層產(chǎn)生瞬時(shí)鎮(zhèn)痛效果。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1實(shí)驗(yàn)材料

胎牛血清、MEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白、B-27supplement（Gibco公司）;胰島素、葡萄糖、HEPES、阿糖胞苷、EGTA、多聚賴氨酸（Sigma公司）;二甲苯、丙酮、無(wú)水乙醇等有機(jī)溶劑（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;CNQx、印防已毒素（PTX）（Toeris）;河豚毒素（TTX）（Affix Scientific）。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1實(shí)驗(yàn)溶液配制

按照溶液配制方法配制多聚賴氨酸溶液、神經(jīng)元解剖液，神經(jīng)元培養(yǎng)基，電生理細(xì)胞外液，電生理細(xì)胞內(nèi)液。

2.2.2小鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的獲取

取出生24h內(nèi)的KM小鼠，在無(wú)菌環(huán)境下斷頭取腦，分離出大腦皮層，用0.25%的胰蛋白酶在37。C恒溫環(huán)境中消化12min，用神經(jīng)元培養(yǎng)基離散細(xì)胞后，滴種在用多聚賴氨酸提前鍍過(guò)的玻片上，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱，分別在第1d、第4d和第9d換液。

2.2.3電生理記錄

取體外培養(yǎng)成熟的小鼠大腦皮層神經(jīng)元進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在記錄過(guò)程中，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，在-70mV的鉗制電壓下記錄電流。當(dāng)記錄mEPSC時(shí)，會(huì)在細(xì)胞外液中加入100uM的GABA受體阻斷劑PTX和1uM的Na通道阻斷劑TTX;當(dāng)記錄mIPSC時(shí)，會(huì)在細(xì)胞外液中加入10uM的AMPA受體阻斷劑CNQX和1肛M的Na通道阻斷劑TTX。

2.3數(shù)據(jù)處理

用Pclamp 10導(dǎo)出數(shù)據(jù)后，再用GraphPad Prism進(jìn)行處理分析，用Illustrator繪制圖形。

3結(jié)果與分析

為了研究TSS在小鼠大腦皮層中的瞬時(shí)鎮(zhèn)痛作用，取體外培養(yǎng)成熟的神經(jīng)元進(jìn)行電生理記錄。記錄了瞬時(shí)改變細(xì)胞外液中TSS濃度對(duì)小鼠大腦皮層神經(jīng)元mEPSC的影響，首先在細(xì)胞浴槽中加入1mL正常外液，記錄mEPSC，記作對(duì)照組;然后運(yùn)用給藥系統(tǒng)加入1mL濃度為2ug/mL TSS溶液，使細(xì)胞外液中TSS濃度為1ug/mL，記錄mEPSC;再加入1mL濃度為28ug/mL TSS溶液，使細(xì)胞外液中TSS濃度為10ug/mL，記錄mEPSC。分析統(tǒng)計(jì)mEPSC的頻率和幅值，并對(duì)對(duì)照組的頻率和幅值進(jìn)行歸一化處理。

結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)三組數(shù)據(jù)的頻率和幅值均沒(méi)有顯著性變化，即瞬時(shí)改變細(xì)胞外液中的TSS濃度對(duì)小鼠大腦皮層神經(jīng)元自發(fā)性興奮性突觸釋放沒(méi)有影響。

由于瞬時(shí)改變TSS濃度對(duì)mEPSC沒(méi)有影響，那么對(duì)mIPSC是否有影響呢。于是采用同樣的實(shí)驗(yàn)方法記錄了正常外液和1ug/mL TSS溶液以及10ug/mLTSS溶液下小鼠大腦皮層神經(jīng)元的mIPSC，同樣進(jìn)行歸一化處理，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度TSS下記錄到mIPSC沒(méi)有變化。綜上所述，瞬時(shí)改變TSS濃度對(duì)小鼠大腦皮層神經(jīng)元的自發(fā)性突觸釋放沒(méi)有影響，也就是說(shuō)，TSS在小鼠大腦皮層中的瞬時(shí)鎮(zhèn)痛效果不顯著。

4結(jié)論與展望

本文對(duì)TSS在小鼠大腦皮層中的瞬時(shí)鎮(zhèn)痛效果進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)短時(shí)間改變神經(jīng)元細(xì)胞外液中TSS濃度對(duì)自發(fā)性興奮性突觸釋放和抑制性突觸釋放均沒(méi)有影響，因此TSS在小鼠大腦皮層中的瞬時(shí)鎮(zhèn)痛效果不明顯。有研究表明在10ug/mL TSS溶液中孵育60min后小鼠大腦皮層神經(jīng)元的自發(fā)性突觸釋放有增強(qiáng)作用，并且在動(dòng)物水平上通過(guò)熱板實(shí)驗(yàn)、冰醋酸扭體、福爾馬林致痛、辣椒素致痛等實(shí)驗(yàn)中有顯著的鎮(zhèn)痛效果。因此，TSS在動(dòng)物水平上是否有瞬時(shí)的鎮(zhèn)痛效果，這一研究還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。