金宇 陳恒玲 林顯光

摘要：指出了阿片類藥物誘導(dǎo)的痛覺過敏（Opioid-induced hyperalgesia，OIH）是臨床上的一個(gè)棘手問題，由于其發(fā)生機(jī)制尚不明確，故目前還沒有一種良好的治療方法。背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal root ganglia，DRG）是感覺傳遞的初級(jí)神經(jīng)元所在部位，是機(jī)體疼痛信號(hào)處理乃至編碼和傳遞的重要部位。已有研究認(rèn)為阿片誘導(dǎo)的痛覺過敏也涉及DRG，但DRG參與阿片誘導(dǎo)的痛覺過敏的具體機(jī)制不詳。為此，在動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上篩選出了可能參與痛覺過敏發(fā)生的基因Crtacl，對(duì)其參與大鼠痛覺過敏的機(jī)制分別開展了初步的研究。首先，在大鼠頸部皮下反復(fù)注射枸櫞酸芬太尼構(gòu)建OIH模型，通過甲基化測序發(fā)現(xiàn)Crtacl在OIH組的DRG中與對(duì)照組的有顯著差異。其次，通過半定量PCR發(fā)現(xiàn)Crtacl基因表達(dá)量在OIH大鼠的DRG中明顯上調(diào)，這說明Crtacl可能在DRG水平上參與著痛覺過敏的發(fā)生。針對(duì)在DRG上參與OIH的調(diào)控作用進(jìn)行的研究，有助于研究OIH的發(fā)生機(jī)制和信號(hào)通路，提供新的潛在治療OIH的藥物靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：OIH;芬太尼;背根神經(jīng)節(jié);基因Crtacl

中圖分類號(hào)：Q71 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944（2019）20-0144-03

1引言

在日常生活中，疼痛一直都是非常令人討厭的，但是當(dāng)身體發(fā)生疾病或者處于危險(xiǎn)境況的時(shí)候，它卻提供了明確的危險(xiǎn)信號(hào)。一直以來，疼痛的感知和傳遞都是重要的研究對(duì)象。臨床上，阿片類藥物常被作為手術(shù)過程中的麻醉劑，其鎮(zhèn)痛效果十分明顯。但是，停藥數(shù)小時(shí)以后往往會(huì)出現(xiàn)一個(gè)與其鎮(zhèn)痛效果相矛盾的現(xiàn)象，鎮(zhèn)痛效應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橥疵粜?yīng)。研究者把這個(gè)現(xiàn)象稱為阿片類藥物誘導(dǎo)的痛覺過敏（opioid-induced hyperalge-sia，OIH）。OIH是目前臨床上難以解決的問題，有關(guān)OIH的信號(hào)通路和發(fā)生機(jī)制仍然很不明確。背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal root ganglia，DRG）細(xì)胞可以對(duì)外周傷害性疼痛信號(hào)進(jìn)行處理和傳遞，它在疼痛的研究中一直扮演著重要角色，在探究痛敏形成機(jī)制和痛覺傳導(dǎo)機(jī)制時(shí)都離不開DRG細(xì)胞。

通過甲基化測序篩選芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏在大鼠DRG中的相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組Crtacl這個(gè)基因在0IH組有明顯上調(diào)，其p值為0.0167，LogFC值為-1.92217，甲基化測序結(jié)果如圖1所示。

Crtacl（軟骨酸性蛋白1）是人類軟骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，也存在于眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)中。Crtacl在脊椎動(dòng)物、非脊椎動(dòng)物等真核生物以及一些原核生物中表達(dá)，并在生物進(jìn)化的過程中被保留下來，表明它具有十分重要的作用。Crtacl的結(jié)構(gòu)模型顯示，它屬于β類蛋白，且族哺乳動(dòng)物的某些疾病，包括阿爾茨海默癥等淀粉樣蛋白病相關(guān)。近年來也有研究表明Crtacl與人類晶狀體上皮細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，且可能成為白內(nèi)障治療的新靶點(diǎn)。然而目前有關(guān)痛覺過敏的文獻(xiàn)中很少見對(duì)這個(gè)基因的研究和探討。在痛覺過敏的研究中，將OIH與DRG聯(lián)系在一起進(jìn)行研究的也并不多。本研究通過PCR技術(shù)確定Crtacl基因在mRNA水平上的表達(dá)差異，旨在為研究OIH發(fā)生機(jī)制提供一些參考并為治療OIH提供新的可能的靶點(diǎn)和方法。

2材料與方法

2.1實(shí)驗(yàn)材料

本課題使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均來自湖北疾控中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，為無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）的Sprague Dawley（SD）實(shí)驗(yàn)大鼠，體重60～80g。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物房溫度保持23士2℃，光照一黑暗時(shí)間12～12h，期間自由進(jìn)食飲水，保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于健康且安靜的狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)方法和條件、使用及處死均符合有關(guān)法律和規(guī)章的要求。在大鼠頸部皮下反復(fù)注射枸櫞酸芬太尼構(gòu)建OIH模型后，該模型鼠用于背根神經(jīng)節(jié)RNA提取及后續(xù)的半定量PCR實(shí)驗(yàn)。

2.2痛覺過敏模型的制備

參考文獻(xiàn)提供的方法，測量SD大鼠機(jī)械刺激縮足閾（PWMT，g）。選取痛閾均在正常水平的大鼠，造模前一天隨機(jī)將大鼠分成對(duì)照組和痛覺過敏組，對(duì)兩組大鼠進(jìn)行上述痛閾測定（DO值）。痛覺過敏組在大鼠頸部進(jìn)行皮下注射枸櫞酸芬太尼注射液，從而制備OIH動(dòng)物模型。單次注射劑量為60ug/kg，每隔15min注射一次，共四次，總注射劑量為240ug/kg。對(duì)照組在頸部進(jìn)行皮下注射，以相同的時(shí)間間隔注射與痛覺過敏組相同體積（約1.2mL/kg）的生理鹽水。

2.3總RNA的提取和cDNA的制備

參考文獻(xiàn)[11，12]提供的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程，用TRIzol法提取總RNA。紫外分析RNA樣品，計(jì)算其A260/A280、A260/A230的值。一般認(rèn)為，質(zhì)量高的RNA樣品，A260/A280應(yīng)為1.8～2.0，A260/A230應(yīng)大于2.0。經(jīng)分析合格后，每個(gè)樣品中加1uL RRI（RNA酶抑制劑）后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以總RNA為模板，按照擎科GoldenstarTM RT6cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)結(jié)束后將得到的cDNA模板置于-20℃中保存。

2.4半定量PCR（Reverse Transcription PCR。RT-PCR）分析

半定量PCR的引物由Primer 5設(shè)計(jì)，內(nèi)參基因?yàn)镠prtl，表1為RT-PCR的反應(yīng)引物序列。

按表2加入各組分。實(shí)驗(yàn)的先決條件是將內(nèi)參基因Hprt調(diào)平，通過調(diào)整加樣量，使整個(gè)反應(yīng)體系中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的cDNA模板量一致，進(jìn)而比較目的基因表達(dá)量的差異。

結(jié)合Primer 5給出的退火溫度（Tm值）設(shè)定不同的階梯溫度進(jìn)行一次PCRl3，根據(jù)結(jié)果分析選用最適宜的退火溫度。最終按照如表3的條件進(jìn)行擴(kuò)增。

3結(jié)果與分析

3.1利用芬太尼制備大鼠痛覺過敏模型。并在不同時(shí)

間點(diǎn)對(duì)其機(jī)械痛進(jìn)行測量。與對(duì)照組進(jìn)行比較

對(duì)比Saline組來看，大鼠頸部皮下注射芬太尼之后的4h內(nèi)，F(xiàn)entanyl組大鼠的機(jī)械痛閾（PWMT）明顯升高（P<0.001），芬太尼表現(xiàn)為明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng);從第5個(gè)小時(shí)開始，F(xiàn)entanyl組大鼠的PWMT的值便開始下降，持續(xù)的在5h、6h、7h、8h、9h、12h、D1、D2、D3中均明顯的有下降趨勢（P<0.05），且在6.5h時(shí)出現(xiàn)了機(jī)械痛閾和熱痛閾值的最低點(diǎn)（P<0.001），此時(shí)芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏現(xiàn)象最為明顯;由第4天（D4）開始，F(xiàn)enta-nyl組大鼠的痛閾開始回升，其PWMT的值與Saline組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），直到第5天（D5）測量結(jié)束，二者均沒有反彈跡象，認(rèn)為其痛閾已恢復(fù)至正常水平。結(jié)果展示見圖2。

3.2Hmgcs2基因在痛覺過敏大鼠的DRG中mRNA表達(dá)量的變化

將大鼠進(jìn)行隨機(jī)分為兩組，一組注射生理鹽水為Control組，一組注射芬太尼為OIH組，注射方式見本文2.2小節(jié)。在確認(rèn)造模成功后立即將大鼠的DRG急性分離，快速進(jìn)行RNA提取，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和半定量PCR。以Hprtl為內(nèi)參基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，在mRNA水平上，基因Crtacl在OIH大鼠的DRG中表達(dá)量上調(diào)。

4結(jié)論與展望

一直以來，疼痛都是人類健康的最大“敵人”之一，也嚴(yán)重的影響著人類的生活質(zhì)量。而人們也一直沒有停止與之對(duì)抗，隨著越來越深入的研究報(bào)道，越來越多治療疼痛的新的藥物靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，而臨床上用于鎮(zhèn)痛的“金標(biāo)藥”依舊是阿片類藥物。但是使用阿片類藥物所帶來的痛覺過敏癥狀依舊是一個(gè)棘手的問題。所以，本課題成功構(gòu)建芬太尼誘導(dǎo)的大鼠痛覺過敏模型，并以此模型為基礎(chǔ)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)大鼠DRG進(jìn)行提取，通過甲基化測序篩選出在OIH狀態(tài)下具有顯著性差異的基因Crtacl。將成功造模后的大鼠急性分離DRG提取RNA進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)在mRNA水平上，Crtacl的表達(dá)量在OIH大鼠DRG中有明顯的升高。

干涉DRG中的Crtacl表達(dá)，可能在一定程度抑制芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏發(fā)生。然而目前關(guān)于Crtacl參與OIH以及其作用機(jī)制還沒有相關(guān)報(bào)道。本課題的研.究內(nèi)容至少在DRG上一定程度上揭示了，Crtacl可能在OIH發(fā)生的過程中扮演了重要角色，未來的研究可以將Crtacl作為潛在的治療OIH的新靶點(diǎn)。