張 智 俞 丹 劉 飛 劉煥章

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所水生生物多樣性與保護(hù)重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

西昌華吸鰍(Sinogastromyzon sichangensis)隸屬于鯉形目(Cypriniformes), 爬鰍科(Balitoridae), 華吸鰍屬(Sinogastromyzon), 是長江上游特有的一種小型魚類, 主要分布于長江上游干流及部分支流[1]。赤水河為長江右岸一級支流, 流經(jīng)滇、川、黔, 于四川省合江縣匯入長江, 全長466 km。西昌華吸鰍是赤水河上、中游及部分支流的常見種[2], 喜急流環(huán)境, 利用腹鰭愈合成的吸盤棲息于溪流的砂石上[3]。目前, 關(guān)于西昌華吸鰍的研究報道較少, 早期多見于生物學(xué)研究[4—6]及保護(hù)生物學(xué)研究[7—10]。近年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展, 相關(guān)類群的系統(tǒng)發(fā)育研究逐漸展開[11—13], 李小娟[14]基于線粒體Cytb及核基因(EGR2、BIRBP、Zic1)對華吸鰍屬魚類物種分化進(jìn)行了研究。但是西昌華吸鰍的種群遺傳學(xué)研究仍然缺乏。

微衛(wèi)星DNA標(biāo)記由于具有共顯性、高度遺傳多態(tài)性和等位基因分型難度低等優(yōu)點, 得到了廣泛的應(yīng)用, 而高多態(tài)性的微衛(wèi)星位點也已成為種群遺傳學(xué)研究的普遍選擇[15]。本研究利用高通量測序技術(shù)共篩選出西昌華吸鰍29對具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物, 并利用其中20對引物對赤水河4個地理種群的遺傳多樣性、種群分化及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,為長江上游特有魚類的保護(hù)積累資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與總DNA提取

2016年5月至9月分別于赤水河源頭云南水田鎮(zhèn)(ST), 上游四川赤水鎮(zhèn)(CSZ), 中游貴州茅臺鎮(zhèn)(MT)及赤水河支流習(xí)水河官渡鎮(zhèn)(XS)河段采集西昌華吸鰍樣本(圖 1), 每個地點各取30尾西昌華吸鰍剪取背部肌肉固定于95%乙醇溶液, 保存于中國科學(xué)院水生生物研究所淡水魚類博物館。基因組DNA的提取采用高鹽抽提法[16], 并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量, 置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 高通量測序、微衛(wèi)星位點挖掘及篩選

使用Illumina Miseq測序儀對西昌華吸鰍一個個體的基因組DNA進(jìn)行全基因組測序, 過濾掉接頭、低質(zhì)量序列后先進(jìn)行基因組組裝, 之后通過MISA軟件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對微衛(wèi)星位點進(jìn)行搜索。選取重復(fù)類型三堿基或四堿基, 重復(fù)次數(shù)大于5且長度在70—500 bp的片段進(jìn)行引物開發(fā), 引物設(shè)計在NCBI的Primer-BLAST網(wǎng)頁(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在線完成[17]。

隨機(jī)選取8尾西昌華吸鰍個體的基因組DNA尾模板對設(shè)計的引物進(jìn)行篩選并優(yōu)化反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系包括100 ng模板DNA, 10 μL 2×Master Mix (TSKINGKE), 上下游引物各1 μL并用滅菌水補(bǔ)充至20 μL總體系。PCR反應(yīng)程序為: 95℃預(yù)變性5min; 95℃變性30s, Tm退火30s (表 1), 72℃延伸45s, 以上程序30個循環(huán)重復(fù); 最后72℃延伸5min。反應(yīng)產(chǎn)物采用30%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測, 經(jīng)Ultra GelRed (Vazyme) 水溶液浸染后,在GeneSnap (Syngene) 紫外成像系統(tǒng)下拍照保存。

1.3 種群擴(kuò)增與讀帶

選取20對多態(tài)性引物, 對赤水河4個不同地理種群的西昌華吸鰍進(jìn)行擴(kuò)增, 反應(yīng)體系和程序同上, 利用pBR322DNA/MspⅠ和pUC18DNA/MspⅠ (Tiangen)為參照以確定不同位點等位基因大小。利用GeneSnap凝膠成像系統(tǒng)自動標(biāo)記擴(kuò)增的PCR片段并輔以人工校正, 與pBR及pUC進(jìn)行比較, 最后讀取不同等位基因大小。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

原始數(shù)據(jù)通過CONVERT 1.31軟件轉(zhuǎn)化為各軟件所需格式[18]。利用MICRO-CHECKER軟件檢查有無出現(xiàn)等位基因缺失、無效等位基因 (Null allele)或者由于結(jié)巴帶(Shutter)引起的錯配等情況[19]。通過GENEPOP檢驗微衛(wèi)星位點是否符合哈迪溫伯格平衡[20]。利用Cervus 3.03軟件計算幾個不同地理種群西昌華吸鰍的等位基因數(shù)(Number of alleles,Na)、觀測雜合度(Observed heterozygosity,Ho)和期望雜合度(Expected heterozygosity,He)、多態(tài)信息含量(Polymorphic information content,PIC)[21]。利用Arlequin3.5軟件估算幾個種群的遺傳分化指數(shù)(Fst)并進(jìn)行分子變異分析方法(AMOVA)分析[22]。通過Structure軟件對西昌華吸鰍種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[23, 24]。

圖1 赤水河流域采樣圖Fig. 1 Sampling sites in Chishui River

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星標(biāo)記篩選

高通量測序共獲得34401條存在微衛(wèi)星位點的序列。在檢出的微衛(wèi)星序列中, 二核苷酸占優(yōu)勢,占全部微衛(wèi)星序列的51.50%; 三核苷酸次之, 占總序列的34.54%; 其次是四核苷酸, 為6.46%; 五、六核苷酸最少, 合計占總序列的7.50%。根據(jù)微衛(wèi)星位點篩選要求和引物設(shè)計原則, 共設(shè)計144對引物,其中52對引物成功擴(kuò)增, 但只有29對引物顯示了較高的多態(tài)性, 引物基本信息詳見表 1。

表1 西昌華吸鰍微衛(wèi)星位點及PCR引物信息Tab. 1 Information of polymorphic microsatellite markers of S. sichangensis

2.2 種群遺傳多樣性及遺傳分化

選取20對多態(tài)性較高的引物對西昌華吸鰍4個地理種群進(jìn)行擴(kuò)增, 種群遺傳多樣性結(jié)果如表 2所示。西昌華吸鰍四個地理種群的等位基因數(shù)在7—28; 赤水鎮(zhèn)種群平均觀測雜合度最高, 為0.669;水田鎮(zhèn)種群的期望雜合度最高, 為0.890; 茅臺鎮(zhèn)種群觀測雜合度和期望雜合度最低, 分別為0.520和0.867; 習(xí)水河種群平均多態(tài)信息含量最高為0.868。4個種群分別有2到8個位點偏離哈迪溫伯格平衡,所有地理種群西昌華吸鰍的平均多態(tài)信息含量均大于0.86, 表明西昌華吸鰍幾個種群的遺傳多樣性處于較高水平。

表2 西昌華吸鰍4個種群微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳學(xué)特征Tab. 2 Characteristics of the 20 microsatellite loci in 4 populations of S. sichangensis

對西昌華吸鰍4個地理種群進(jìn)行遺傳分化指數(shù)計算并進(jìn)行顯著性檢驗(表 3), 結(jié)果顯示, 水田鎮(zhèn)、赤水鎮(zhèn)、茅臺鎮(zhèn)三個種群間無顯著分化, 而習(xí)水河種群與其他3個種群均存在顯著差異(Fst全部大于0.25,P＜0.01)。分子方差分析顯示(表 4), 遺傳變異主要來源于群體內(nèi)(96.67%), 群體間的遺傳變異僅為3.33%。

表3 西昌華吸鰍4個種群間的遺傳分化系數(shù)Tab. 3 Pairwise Fst estimates 4 populations of S. sichangensis

表4 赤水河西昌華吸鰍分子變異分析Tab. 4 Analysis of molecular variance (AMOVA) for S.sichangensis

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)

利用Structure軟件進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)分析, 計算得出K=2是比較理想的種群亞型類群數(shù)目, 即4個種群120尾西昌華吸鰍個體可分為兩個亞類群, 如圖 2所示, 不同灰度分別代表不同的亞類群, 其中水田鎮(zhèn)、赤水鎮(zhèn)及茅臺鎮(zhèn)種群的遺傳背景整體趨于一致, 而習(xí)水河種群則單獨聚于另外一個亞類群, 與遺傳分化分析結(jié)果相一致。

3 討論

3.1 微衛(wèi)星引物篩選

傳統(tǒng)的微衛(wèi)星分離技術(shù)包括小片段DNA克隆法和微衛(wèi)星富集文庫法[25]。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展, 具有通量大、成本低、周期短特點的高通量測序?qū)蚪M進(jìn)行隨機(jī)測序即可獲得大量的微衛(wèi)星序列, 相比傳統(tǒng)方法在獲取微衛(wèi)星序列方面展現(xiàn)出了突出的優(yōu)勢[26,27]。特別是對于西昌華吸鰍這類DNA序列數(shù)據(jù)較為貧乏的物種, 利用高通量測序獲取微衛(wèi)星序列的技術(shù)難度減小且效率大幅提高。因此, 高通量測序法必將逐步取代傳統(tǒng)方法,成為微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)領(lǐng)域的主流。

圖2 西昌華吸鰍種群結(jié)構(gòu)分析Fig. 2 Population structure of S. sichangensis

3.2 西昌華吸鰍種群遺傳學(xué)特征

生物多樣性包括遺傳多樣性、物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性, 其中遺傳多樣性既是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎(chǔ), 也是生物多樣性的核心和重要組成部分。雜合度是描述群體遺傳學(xué)上的群體多態(tài)性, 當(dāng)雜合度在0.5到0.8之間即可認(rèn)為該群體具有較高的多樣性[28]。在本研究中, 西昌華吸鰍在赤水河及其支流的4個種群的觀測雜合度值均大于0.5, 表明各種群遺傳多樣性現(xiàn)狀均處于較高水平。多態(tài)信息含量也是衡量基因片段多態(tài)性的理想指標(biāo), Botstein等[29]認(rèn)為當(dāng)PIC＞0.5時, 該位點即為高度多態(tài)位點。本實驗中各種群PIC均大于0.5, 表明西昌華吸鰍各種群遺傳多樣性高, 說明這些種群種質(zhì)資源良好, 具有一定的種群穩(wěn)定性。

3.3 西昌華吸鰍種群分化與遺傳特征

遺傳分化指數(shù)Fst是揭示種群間遺傳分化程度的重要參數(shù)。Wright[30]認(rèn)為: 若種群間Fst＜0.05, 則表明種群間無分化; 若0.05＜Fst＜0.15, 則表明種群間存在中度分化; 若0.15＜Fst＜0.25, 則為高度分化。在本研究中, 赤水河干流水田、赤水鎮(zhèn)、茅臺種群間遺傳分化指數(shù)均小于0.05, 表明干流種群間無顯著分化; 而習(xí)水河種群與干流種群Fst均大于0.25, 存在高度分化。種群遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果同樣與上述結(jié)果一致, 習(xí)水河種群單獨聚為一個亞類群, 而干流種群遺傳背景趨于一致, 聚為另一個亞類群。

西昌華吸鰍與四川華吸鰍相似, 產(chǎn)微黏性卵,在自然條件下常黏附于河流激流礫石灘上完成胚胎發(fā)育過程, 由于黏性較弱, 受水流沖擊后常脫離基質(zhì)順?biāo)鱗31]。習(xí)水河與赤水河交匯于赤水河下游近河口處, 與赤水河上游和中游種群難以進(jìn)行基因交流, 進(jìn)而逐漸分化成獨立的亞群。

西昌華吸鰍是我國長江上游地區(qū)的特有類群, 具有重要的遺傳價值和生態(tài)價值。近年來野外調(diào)查也發(fā)現(xiàn)西昌華吸鰍的種群規(guī)模呈下降趨勢。因此, 在今后的管理中仍應(yīng)加大赤水河水質(zhì)的保護(hù)力度, 為長江上游特有水生生物資源提供良好的棲息環(huán)境。

致謝：

感謝中國科學(xué)院水生生物研究所王雪、張富斌、秦強(qiáng)在野外采樣給予的幫助。