卓曉菲 何蘋(píng)萍 韋嬪媛 陳曉漢 彭金霞

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 南寧 530004; 2. 廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院, 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南寧 530021)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)是世界上養(yǎng)殖最廣泛的對(duì)蝦種類(lèi)之一。在養(yǎng)殖對(duì)蝦時(shí), 不同的環(huán)境脅迫因子, 包括鹽度、pH和溫度的變化, 會(huì)導(dǎo)致其生長(zhǎng)和存活率降低, 增加疾病的易感性, 甚至導(dǎo)致死亡[1,2]。凡納濱對(duì)蝦起源于熱帶, 后被推廣至亞熱帶地區(qū)養(yǎng)殖, 低溫對(duì)其生存及生長(zhǎng)造成極大的影響[3]。目前關(guān)于南美白對(duì)蝦應(yīng)對(duì)低溫反應(yīng)分子機(jī)制的研究很少, 僅僅有運(yùn)用SSH[3]和蛋白質(zhì)組學(xué)[4]分析南美白對(duì)蝦低溫反應(yīng)分子機(jī)制的研究。

小RNA是能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)的短的非編碼RNA。這些核苷酸可以全部或部分互補(bǔ)結(jié)合到mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR), 這將抑制靶基因的翻譯。眾所周知, miRNAs在調(diào)節(jié)許多真核細(xì)胞的過(guò)程中有重要的作用, 包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡、能量代謝、癌癥的發(fā)展以及免疫防御等方面有重要的作用[5]。自從2001年首次發(fā)現(xiàn)miRNA以來(lái), 許多研究人員已經(jīng)證明, 在許多物種中, miRNA在不同的環(huán)境脅迫下表現(xiàn)出差異表達(dá)。研究已證實(shí),miR-1-3p、miR-14、mir-31a-3p和miR-284-3p在昆蟲(chóng)低溫適應(yīng)過(guò)程中參與調(diào)控[6]; tsc-miR-20a和tscmiR-21在龜?shù)牡蜏孛{迫過(guò)程中參與調(diào)控[5]。已有的水生生物應(yīng)對(duì)低溫脅迫的miRNA表達(dá)研究包括斑馬魚(yú)腦組織在低溫脅迫下的差異miRNA表達(dá)等[7]。然而, 針對(duì)凡納濱對(duì)蝦的低溫適應(yīng)miRNAs及靶基因的研究仍然十分匱乏。到目前為止, 對(duì)凡納濱對(duì)蝦miRNA的研究主要集中在免疫防御方面, 如感染白斑綜合征病毒后miRNA的表達(dá)變化[8]。由于肝胰腺是參與凡納濱對(duì)蝦免疫、造血、代謝、解毒的重要器官, 故選擇其進(jìn)行分析[9]。并且已有研究證明, 在低溫脅迫之后, 低溫反應(yīng)基因在凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中有較高的表達(dá)水平[3]。因此我們利用Solexa對(duì)凡納濱對(duì)蝦在常溫(28℃)及低溫鍛煉(16℃, 6d)下的肝胰腺小RNA進(jìn)行測(cè)序, 并運(yùn)用qRT-PCR驗(yàn)證差異顯著的miRNAs以及靶基因的表達(dá)模式, 以期能初步解析miRNAs在凡納濱對(duì)蝦低溫適應(yīng)過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 低溫脅迫實(shí)驗(yàn)及樣品采集

從防城港水產(chǎn)養(yǎng)殖基地獲得凡納濱對(duì)蝦數(shù)10只(3個(gè)月大, 體重10—15 g), 在廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院水族館飼養(yǎng), 并在實(shí)驗(yàn)前一周讓其適應(yīng)28℃水溫, 30%—35%鹽度的條件。實(shí)驗(yàn)組以每2小時(shí)1℃的速度降溫, 直至16℃。實(shí)驗(yàn)組在16℃水溫維持6d,在低溫到達(dá)0、24h、72h和144h的時(shí)候分別采集對(duì)蝦肝胰腺樣本。對(duì)照組水溫維持在28℃, 并且和實(shí)驗(yàn)組(16℃)在同樣的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采樣。采集的樣品立即保存在液氮或RNA保護(hù)液(上海捷瑞)中, 后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱。

1.2 小RNA測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序

常溫、低溫處理每個(gè)取樣點(diǎn)選擇3尾蝦, 分別用Trizol reagent (Invitrogen)提取肝胰腺的總RNA,等量混合后, 電泳分離16—30 nt的小分子 RNA, 進(jìn)行Solexa高通量測(cè)序。小RNA 文庫(kù)的Solexa測(cè)序由北京諾禾致源生物公司完成。

1.3 生物信息學(xué)分析

在測(cè)序完成后, 首先去除接頭序列及低質(zhì)量序列, 用bowtie將長(zhǎng)度篩選后的sRNA 定位到凡納濱對(duì)蝦的轉(zhuǎn)錄組參考序列上, 然后將上述mapped到參考序列上的reads, 與Rfam database (11.0, http://Rfam.sanger.ac.uk/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 除去snRNA、snoRNA、rRNA、tRNA和重復(fù)序列, 剩下的序列在miRBase (version18.0, http://www.mirbase.org/)中進(jìn)行比對(duì), 完全匹配的為已知的成熟miRNA序列。進(jìn)一步運(yùn)用miREvo[10]和mirdeep2[11]軟件來(lái)預(yù)測(cè)新的miRNA (novel miRNAs)。

1.4 顯著差異miRNA的表達(dá)分析

在進(jìn)行差異miRNA 表達(dá)分析時(shí), 對(duì)各樣本中已知和新的miRNA進(jìn)行表達(dá)量的統(tǒng)計(jì), 用TPM進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理。使用DEGseq (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DEG-seq.html)對(duì)常溫及低溫組的miRNAs進(jìn)行差異表達(dá)分析。為進(jìn)一步驗(yàn)證獲得的差異顯著miRNAs的表達(dá)規(guī)律, 采用莖環(huán)RT-qPCR對(duì)凡納濱對(duì)蝦在常溫及不同低溫鍛煉條件下的肝胰腺進(jìn)行了相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)分析, 常溫下肝胰腺的表達(dá)量被設(shè)定為1。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組有3只蝦的肝胰腺作為生物學(xué)重復(fù)。莖環(huán)RT-qPCR所使用的引物如表 1所示。

表1 RT-qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)miRNAs使用的引物序列Tab. 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.5 miRNA靶基因的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步闡明差異表達(dá)miRNAs的生物學(xué)過(guò)程和生理功能, 對(duì)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè), 再根據(jù)miRNA與其靶基因間的對(duì)應(yīng)關(guān)系, 對(duì)每組差異表達(dá)miRNA的靶基因的集合分別進(jìn)行Gene Ontology(GO)和KEGG富集分析。將預(yù)測(cè)出的低溫差異表達(dá)miRNAs的靶基因與課題組前期低溫轉(zhuǎn)錄組分析獲得的低溫顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行比對(duì), 從二者重合的基因集中挑選出4個(gè)基因, 即nuclear export mediator factor Nemf-lik、synapse-associated protein、seleno proteins 以及DEAD-box RNA helicase Variant 1, 運(yùn)用qRT-PCR驗(yàn)證其在低溫不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1 肝胰腺中獲得的miRNAs的基本特征

分別從常溫組和低溫組對(duì)蝦的肝胰腺小RNA文庫(kù)中獲得14754823和14945246條原始序列。去除低質(zhì)量序列、接頭序列和短序列后, 分別篩選出18—32 nt的10690259和8587144條高質(zhì)量序列進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

2.2 已知miRNAs的鑒定

用bowtie將長(zhǎng)度篩選后的sRNA 定位到凡納濱對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組參考序列上, 將定位成功的序列與Rfam database 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 除去tRNAs、rRNAs、snRNA或noRNAs和重復(fù)序列, 從常溫和低溫組對(duì)蝦肝胰腺小RNA文庫(kù)中分別獲得892001條與858237條miRNAs。再將獲得的miRNAs序列在miRBase中進(jìn)行比對(duì), 常溫和低溫組分別鑒定出57及48條已知的成熟miRNAs。

2.3 未知miRNAs的預(yù)測(cè)

運(yùn)用miREvo[10]和mirdeep2[11]軟件來(lái)預(yù)測(cè)新的miRNAs, 從常溫和低溫組對(duì)蝦肝胰腺小RNA文庫(kù)中分別獲得38及46條novel miRNAs。這些未知的miRNAs在表達(dá)水平上存在極大的差異, 從幾十到幾千不等(TPM)。

2.4 miRNAs的差異表達(dá)分析及驗(yàn)證

通過(guò)差異表達(dá)分析獲得25個(gè)低溫鍛煉下顯著差異表達(dá)的miRNAs, 其中有9個(gè)極顯著上調(diào), 2個(gè)極顯著下調(diào)(表 2)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些miRNAs的表達(dá)模式, 運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)肝胰腺進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)。選取2條已知的miRNAs (mja-miR-6494、mja-miR-6491)及1條未知的miRNAs (novel_5)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明, mja-mir-6491、mja-mir-6494和novel_5在低溫相對(duì)于常溫呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)。其中,mja-miR-6494及mja-miR-6491在低溫0表達(dá)水平迅速增加, 并達(dá)到峰值, 之后逐漸減少。而novel_5則是在低溫0表達(dá)水平開(kāi)始增加, 在72h達(dá)到峰值(圖 1)。

表2 miRNAs顯著表達(dá)差異倍數(shù)分析結(jié)果Tab. 2 The fold-change of significantly differentially expressed miRNAs

圖1 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)miRNAs在常溫及不同低溫鍛煉條件下的表達(dá)模式Fig. 1 The relative expression of miRNAs under normal and cold-acclimated conditions assayed by qRT-PCR

2.5 差異表達(dá)miRNAs的靶基因預(yù)測(cè)

對(duì)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè), 再對(duì)每組差異表達(dá)miRNA的靶基因的集合分別進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO總共分為3大功能類(lèi), 分別描述基因的分子功能(Molecular function)、所處的細(xì)胞位置(Cellular component)和參與的生物過(guò)程(Biological process)。GO分析的結(jié)果表明, 這些差異表達(dá)miRNAs的靶基因主要涉及生物過(guò)程(BP)中的生化過(guò)程(Biological process)、細(xì)胞過(guò)程(Cellular process)、代謝過(guò)程(Metabolic process); 細(xì)胞位置(CC)中的細(xì)胞組分(Cellular component); 生物過(guò)程(BP)中的分子功能(Molecular funcion)、結(jié)合(Binding)、蛋白結(jié)合(Protein binding)、催化活性(Catalytic activity)等等。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)記錄細(xì)胞中基因產(chǎn)物的功能以及基因產(chǎn)物的相互作用網(wǎng)絡(luò)。最顯著富集的KEGG通路為脂肪酸的降解 (Fatty acid degradation)及甘油酯代謝(Glycerolipid metabolism, 圖 2)。

2.6 差異表達(dá)miRNAs的靶基因驗(yàn)證

被選取進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證相對(duì)表達(dá)量的4個(gè)基因: synapse-associated protein、nuclear export mediator factor、seleno proteins和DEAD-box RNA helicase Variant 1均為差異表達(dá)倍數(shù)極高的miRNAs的靶基因, 同時(shí)為課題組前期低溫轉(zhuǎn)錄組分析獲得的低溫顯著差異表達(dá)基因。部分顯著差異表達(dá)miRNAs的靶基因列表如表 3所示。熒光定量PCR的引物序列見(jiàn)表 4。如圖 3所示, synapse-associated protein及nuclear export mediator factor為低溫下調(diào)基因, 而seleno proteins及DEAD-box RNA helicase Variant 1為低溫上調(diào)基因。synapse-associated protein的表達(dá)量在低溫72h達(dá)到最低, nuclear export mediator factor在低溫24h達(dá)到最低。而DEAD-box RNA helicase Variant 1及seleno proteins的表達(dá)量在低溫72h達(dá)到最高。

圖2 差異表達(dá)miRNAs的靶基因KEGG通路預(yù)測(cè)Fig. 2 Prediction of target gene KEGG pathway for differentially expressed miRNAs

3 討論

自2001年首次發(fā)現(xiàn)miRNAs以來(lái), 許多研究人員已經(jīng)證實(shí)了miRNAs在多種動(dòng)物應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力下的作用。在海龜中, 一些miRNAs, 包括tsc-miR-20a和tsc-miR-21, 可以調(diào)節(jié)缺氧和低溫反應(yīng)下細(xì)胞的關(guān)鍵變化[12]。在昆蟲(chóng)中, miR-1-3p和miR-284-3p被鑒定出在低溫反應(yīng)中起重要的作用[13]。然而,凡納濱對(duì)蝦低溫反應(yīng)miRNAs的數(shù)據(jù)仍然十分匱乏。迄今為止, 凡納濱對(duì)蝦miRNAs的研究主要集中在免疫防御上[7]。為了研究miRNAs在凡納濱對(duì)蝦低溫適應(yīng)中的作用, 我們?cè)O(shè)計(jì)了低溫鍛煉實(shí)驗(yàn)。通過(guò)高通量測(cè)序, 我們從常溫和低溫組對(duì)蝦肝胰腺小RNA文庫(kù)中鑒定出了miRNAs。表達(dá)分析表明,25個(gè)miRNAs在低溫下存在顯著的差異表達(dá)。在鑒定出的差異表達(dá)miRNAs中, mja-miR-6494和mjamiR-6491已被報(bào)道與日本對(duì)蝦的病毒感染有關(guān)[14]。此外, bta-miR-2478已被報(bào)道與牛的病毒感染有關(guān)[15]。因此我們推測(cè)miRNA在多種脅迫響應(yīng)中具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。

表3 部分顯著差異表達(dá)miRNAs的靶基因Tab. 3 Partially significant differential expression of target genes for miRNAs

表4 差異表達(dá)miRNAs的靶基因的熒光定量PCR擴(kuò)增引物Tab. 4 Primer sequences used for RT-qPCR of the targets of differentially expressed miRNA

圖3 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)靶基因在常溫及不同低溫鍛煉條件下的表達(dá)模式Fig. 3 The relative expression of target genes under normal and cold-acclimated conditions assayed by qRT-PCR

mja-miR-6491、mja-miR-6494和novel_5在低溫組對(duì)蝦肝胰腺的表達(dá)水平顯著高于常溫組。而在我們之前的研究中, 低溫脅迫下的凡納濱對(duì)蝦,包括胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶在內(nèi)的消化酶的活性變化顯示出與此相反的模式, 即低溫脅迫24h后, 肝胰腺和胃腸道中這些消化酶的活性開(kāi)始顯著降低[16]。類(lèi)似的研究表明低溫應(yīng)答型miRNA的靶基因在新陳代謝等生物學(xué)過(guò)程中富集[5]。因此推測(cè), 凡納濱對(duì)蝦應(yīng)對(duì)低溫主要的適應(yīng)包括快速降低新陳代謝率等。在本研究中, KEGG途徑分析表明, 靶基因主要富集到與脂肪酸代謝有關(guān)的一些途徑中。此結(jié)果與前人的研究結(jié)果相符合。在大黃魚(yú)中, 脂肪酸的脫飽和是維持膜在低溫脅迫下流動(dòng)性的重要適應(yīng)機(jī)制[17]。在泥鰍中, 超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸酶6 (elovl6)已被證明在適應(yīng)低溫方面起主要作用[18]。

本課題組前期運(yùn)用SSH及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出低溫差異表達(dá)基因DEAD-box RNA helicase Variant的變異體- LvDDX5A, 并驗(yàn)證出其表達(dá)規(guī)律為在18℃、15℃、13℃和11℃低溫脅迫36h均被誘導(dǎo)表達(dá), 并隨著15℃和13℃低溫脅迫時(shí)間的增加呈先上升后下降的表達(dá)模式, 在48h達(dá)到峰值[19]。在本研究驗(yàn)證的差異miRNA靶基因中, DEAD-box RNA helicase Variant 1為低溫上調(diào)基因, 表達(dá)量在16℃低溫鍛煉72h達(dá)到最高, 此結(jié)果與課題組前期研究相符。另外3個(gè)差異miRNA的靶基因-synapse-associated protein、nuclear export mediator factor及seleno proteins也是項(xiàng)目組前期進(jìn)行低溫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中篩選出的顯著差異基因。因此, 這4個(gè)低溫差異miRNAs的靶基因很可能為凡納濱對(duì)蝦的耐寒相關(guān)基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miRNAs對(duì)靶基因的調(diào)控,課題組計(jì)劃將運(yùn)用RNA 免疫共沉淀 CLIP-Seq 技術(shù)對(duì)miRNAs及其靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。