魏曉雷 葉漢梅 羅 智

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070)

細(xì)胞自噬是生物體進(jìn)化過程中的一種保守機(jī)制, 通過降解細(xì)胞質(zhì)中受損細(xì)胞器或蛋白以維持生物體的穩(wěn)態(tài)[1]。迄今為止, 在酵母模型系統(tǒng)中已經(jīng)鑒定出30多種自噬相關(guān)基因(Autophagy-related genes, ATGs), 這些自噬相關(guān)基因參與了細(xì)胞選擇或非選擇性的自噬功能, 而且這些基因中的大多數(shù)在真核生物中具有同源物[2]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP1LC3 orLC3)是酵母Agt8基因在哺乳動(dòng)物中的同源類似物。在黃顙魚中, LC3有2個(gè)亞型, 包括LC3A和LC3B[3]。LC3在細(xì)胞中合成后經(jīng)過加工成為胞質(zhì)型LC3-Ⅰ。細(xì)胞在面臨各種應(yīng)激情況下, 自噬水平改變, LC3-Ⅰ的一部分轉(zhuǎn)換成膜結(jié)合型LC3-Ⅱ并與自噬泡結(jié)合[4]。LC3-Ⅱ是公認(rèn)的自噬體存在的標(biāo)志分子, Western blot檢測(cè)LC3-Ⅱ蛋白含量變化是目前檢測(cè)自噬常用的方法[5]。Beclin1是酵母Atg6基因在哺乳動(dòng)物中的同源類似物, 在多種生物中高度保守[6]。Beclin1通過與ClassⅢ PI3K形成復(fù)合物參與自噬體的形成, Beclin1是調(diào)節(jié)自噬過程的關(guān)鍵性蛋白質(zhì), 是自噬啟動(dòng)的標(biāo)志分子[7]。Beclin1作為調(diào)控自噬形成的關(guān)鍵基因, 參與了很多蛋白質(zhì)的修飾調(diào)控, 進(jìn)而調(diào)控自噬體的形成[8,9]。

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)是我國內(nèi)陸淡水地區(qū)重要養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)魚類, 最近我們實(shí)驗(yàn)室克隆得到了黃顙魚自噬發(fā)生關(guān)鍵基因的cDNA序列[3,10],探討了自噬介導(dǎo)鋅影響黃顙魚脂類代謝的機(jī)制[11]。多克隆抗體具有識(shí)別抗原表位多、制備時(shí)間短、成本低等優(yōu)點(diǎn), 可以應(yīng)用于免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、免疫組化等實(shí)驗(yàn), 成為科研中不可或缺的一部分。然而, 到目前為止, 還沒有高質(zhì)量的黃顙魚LC3和Beclin1抗體, 很大程度限制了對(duì)黃顙魚自噬調(diào)控的深入研究。本研究成功表達(dá)和純化得到了重組PfLC3B和PfBeclin1蛋白, 并分別制備了鼠抗血清, 以期為深入研究黃顙魚自噬發(fā)生的過程和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

5周齡SPF級(jí)Balb/C小鼠由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, Ni-NTA預(yù)裝重力柱(1 mL)購自生工生物工程(上海)股份有限公司, 弗氏佐劑購自Sigma公司,E. coliDH5α和E. coliRosetta(DE3)購自天根生物有限公司, 質(zhì)粒pET32a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存, 黃顙魚購自武漢市漢南區(qū)的五湖漁場(chǎng)。

1.2 方法

pET32a(+)-PfLC3B和pET32a(+)-PfBeclin1重組表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)黃顙魚LC3B基因序列,設(shè)計(jì)含有EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的一步法克隆引物PfLC3B-F和PfLC3B-R。引物序列如下,PfLC3B-F: 5′-GCTGATATCGGATCCGAATTCAT GCATTCAGAAAAGATGTTTAAACAA-3′,PfLC3B-R: 5′-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGT TACTGCGCCGCTCCGAA-3′。

根據(jù)黃顙魚Beclin1基因序列, 設(shè)計(jì)擴(kuò)增PfBeclin1全長的引物B-F和B-R。引物序列如下, B-F:5′-AGTACCATGGAGGGCTCCAA-3′, B-R: 5′-GC CAAAACCAGGGATCAGGG-3′。設(shè)計(jì)含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的一步法克隆引物PfBeclin1-F和PfBeclin1-R。引物序列如下PfBeclin1-F: 5′-GCTGATATCGGATCCGAATTCATGGAGG GCTCCAAGTCATCC-3′和PfBeclin1-R: 5′-GTGGT GGTGGTGGTGCTCGAGTTAACGGTTGTA GAATTGGGATGA-3′。

以黃顙魚cDNA為模版, 以PfLC3B-R/F引物,對(duì)PfLC3B基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 并進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收、純化。以黃顙魚cDNA為模版, 以B-F/R引物, 對(duì)PfBeclin1基因全長進(jìn)行PCR擴(kuò)增; 以上述PCR產(chǎn)物為模版, 以PfBeclin1-F/R引物, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 并進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收、純化。將pET-32a(+)質(zhì)粒用EcoR Ⅰ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切, 采用CloneExpress Ⅱ One Step Cloning Kit將PfLC3B和PfBeclin1基因連接至pET-32a(+)載體中。將原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中, 以pET-32a(+)通用測(cè)序引物(T7: 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′和T7t: 5′-GCTA GTTATTGCTCAGCGG-3′)進(jìn)行PCR菌落鑒定和武漢擎科測(cè)序。

重組PfLC3B和PfBeclin1蛋白表達(dá)和純化將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化至E. coliRosetta(DE3)大腸桿菌中, 挑取經(jīng)菌落PCR鑒定陽性的菌落, 接種至5 mL含有AMP的LB培養(yǎng)基中于37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD≈0.6, 加入IPTG至終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L, 16℃、200 r/min誘導(dǎo)表達(dá)過夜。收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體, 經(jīng)SDS-PAGE鑒定成功表達(dá)后, 對(duì)菌體進(jìn)行高壓破碎,4℃、12000 r/min離心30min分別收集上清和沉淀并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

經(jīng)SDS-PAGE鑒定后, 如果重組蛋白表達(dá)在上清中, 利用Ni-NTA鎳離子親和層析進(jìn)行純化。參照生工生物Ni-NTA純化樹脂預(yù)裝柱操作說明進(jìn)行,純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

如果重組蛋白表達(dá)在沉淀中, 利用包涵體純化重組蛋白。包涵體純化步驟: a. 沉淀使用20 mL buffer A(50 mmol/L Tris-HCl, 5 mmol/L EDTA, pH 8.0)充分懸起, 混勻。4℃離心12000 r/min、20min,去除上清; 重復(fù)一次。b. 沉淀用20 mL buffer B(50 mmol/L Tris-HCl, 5 mmol/L EDTA, 2 mol/L脲,pH 8.0)充分懸起, 混勻。4℃離心12000 r/min、20min, 去除上清; 重復(fù)一次。c. 1%的Triton X-100分別洗滌, 4℃離心12000 r/min、20min, 去除上清; 重復(fù)一次。d. 沉淀用20 mL buffer(0.1 mol/L Tris-HCl, 10 mmol/L DTT, 8 mol/L脲, pH 8.0)充分懸起, 混勻。置于37 ℃恒溫?fù)u床上200 r/min快速震蕩1h。4℃離心12000 r/min、10min, 保留上清, 去除沉淀。e. 上清裝入透析袋中, 置于1 L透析液(0.1 mol/L Tris-HCl, 5 mmol/L EDTA, 5 mmol/L Cysteins, pH 8.0)中, 4℃下透析16h以上。f. 透析袋置于新透析液(1 L)中, 4℃下透析16h以上。4℃離心12000 r/min、10min, 保留上清, 去除沉淀。純化后的蛋白經(jīng)超濾離心管濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

鼠抗PfLC3B和PfBeclin1多克隆抗體的制備將純化的重組PfLC3B和PfBeclin1蛋白分別與等量的完全弗氏佐劑混合, 充分乳化后, 經(jīng)多點(diǎn)皮下注射免疫小鼠。每隔2周加強(qiáng)免疫1次, 使用同樣劑量的重組蛋白和等量的不完全弗氏佐劑充分乳化后進(jìn)行免疫, 共免疫3次。第3次免疫7d后, 眼球取血, 4℃靜置24h, 5000 r/min離心30min, 吸取抗血清。

細(xì)胞培養(yǎng)及處理采用0.25%胰蛋白酶消化的方法分離黃顙魚原代肝細(xì)胞, 并用T25細(xì)胞瓶培養(yǎng)黃顙魚原代肝細(xì)胞, 培養(yǎng)條件: DMEM培養(yǎng)液, 含有鏈霉素(100 ng/mL), 青霉素(100 U/mL)和胎牛血清(5%,v/v)。以終濃度為100 nmol/L的雷帕霉素處理肝細(xì)胞, 設(shè)置未處理的肝細(xì)胞為陰性對(duì)照, 48h后收集細(xì)胞樣品。

動(dòng)物組織和細(xì)胞總蛋白提取分別取黃顙魚腎臟、肝臟和脾臟組織各0.5 g, 以及上述細(xì)胞樣品, 用RIPA裂解液提取總蛋白, 經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度后, 加入SDS上樣緩沖液, 煮沸5min, 于1000×g離心5min, 取上清進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

Western blot檢測(cè)分別將處理后的重組蛋白樣品、細(xì)胞蛋白樣品或者黃顙魚組織蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后, 置濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad, 美國)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上, 用5%脫脂奶粉37℃封閉2h,一抗(鼠多抗PfLC3B、PfBeclin1或兔多抗GAPDH)4℃孵育過夜。TBST洗膜3次, 每次5min, 加入HRP標(biāo)記的的IgG(鼠抗或兔抗, 1:4000稀釋), 37℃孵育45min, TBST洗膜3次, 每次5min, 采用ELC化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 黃顙魚LC3B和Beclin1基因的克隆

根據(jù)已有轉(zhuǎn)錄組序列, 找到PfLC3B序列和Pf-Beclin1序列。以黃顙魚肝臟cDNA作為模版, 進(jìn)行RT-PCR, 分別擴(kuò)增得到PfLC3B和PfBeclin1目的片段。利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè), 可見約為372 bp (圖 1A)和1344 bp (圖 1B)的條帶。

2.2 重組PfLC3B和PfBeclin1蛋白的表達(dá)和純化

將測(cè)序正確的p E T 3 2 a(+)-P f L C 3 B和pET32a(+)-PfBeclin1重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E. coliRosetta(DE3)表達(dá)菌株中, 在經(jīng)過16℃不同濃度IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果顯示, 相對(duì)于未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的E. coliRosetta(DE3)大腸桿菌, 經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后, 分別在約32 kD (圖 2A)和70 kD(圖 2B)處出現(xiàn)特異性目的條帶, 即重組PfLC3B和PfBeclin1蛋白。在不同濃度IPTG誘導(dǎo)后, 重組PfLC3B和PfBeclin1蛋白表達(dá)量并沒有發(fā)生顯著性變化, 所以本實(shí)驗(yàn)將PfLC3B和PfBeclin1的IPTG誘導(dǎo)濃度定為0.1 mmol/L。誘導(dǎo)后的E. coliRosetta(DE3)大腸桿菌經(jīng)過高壓破碎后, SDS-PAGE結(jié)果顯示, 重組PfLC3B蛋白大部分表達(dá)于上清中, 而重組PfBeclin1蛋白大部分表達(dá)于包涵體中。所以重組PfLC3B蛋白純化采用Ni-NTA親和層析的方式,重組PfBeclin1蛋白純化采用包涵體純化方式進(jìn)行。經(jīng)過SDS-PAGE分析, 兩種純化方式分別得到了純度較高的重組PfLC3B和PfBeclin1蛋白。

圖1 PfLC3B和PfBeclin1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR amplification of PfLC3B and PfBeclin1 genes

圖2 重組PfLC3B和PfBeclin1蛋白的表達(dá)和純化的SDSPAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of expressed and purified recombinant PfLC3B and PfBeclin1 protein

2.3 Western blot檢測(cè)

經(jīng)過3次免疫后, 獲得鼠源PfLC3B和PfBeclin1抗血清。利用Western blot檢測(cè)制備的多克隆抗體的特異性, 鼠源PfLC3B抗體可以特異性識(shí)別重組PfLC3B蛋白(圖 3A), 鼠源PfBeclin1抗體可以特異性識(shí)別重組PfBeclin1蛋白(圖 3B)。

由于LC3A和LC3B蛋白具有較高的同源性, 且缺乏直接驗(yàn)證抗體特異性實(shí)驗(yàn)證據(jù), 故不能排除黃顙魚LC3B抗體與LC3A和LC3B發(fā)生交叉反應(yīng)的可能。為進(jìn)一步驗(yàn)證鼠抗PfLC3B和PfBeclin1抗體是否能識(shí)別黃顙魚內(nèi)源性LC3和Beclin1蛋白, 我們用雷帕霉素處理黃顙魚原代肝臟細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,western blot結(jié)果顯示(圖 4), PfLC3B抗體能同時(shí)識(shí)別LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ, 雷帕霉素處理組LC3-Ⅱ表達(dá)量較對(duì)照組有明顯升高, LC3-Ⅱ/GAPDH比值升高,自噬水平增強(qiáng), 說明制備的PfLC3B抗體可以用于檢測(cè)黃顙魚LC3蛋白; 雷帕霉素處理組Beclin1表達(dá)量較對(duì)照組有一定水平的升高, 說明制備的PfBeclin1抗體可以識(shí)別黃顙魚Beclin1蛋白。PfLC3B和PfBeclin1抗血清可以用于自噬的檢測(cè)。

用PfLC3B和PfBeclin1抗血清檢測(cè)黃顙魚腎臟、肝臟和脾臟組織中的LC3和Beclin1蛋白表達(dá)水平(圖 5)。LC3在肝臟組織中表達(dá)量明顯高于腎臟和脾臟, 并且主要以LC3-Ⅰ形式存在。Beclin1在肝臟中表達(dá)量也是最高, 在腎臟和脾臟中有少量表達(dá)。

圖3 Western blot檢測(cè)重組PfLC3B和PfBeclin1蛋白Fig. 3 Detection of recombinant PfLC3B and PfBeclin1 protein using Western blotting

圖4 Western blot檢測(cè)內(nèi)源性LC3和Beclin1蛋白Fig. 4 Western blot detection of endogenous LC3 and Beclin1 proteins

3 討論

LC3是公認(rèn)的自噬標(biāo)志蛋白, 在自噬過程中參與自噬體的形成[4,12], 在LC3的4種亞型中, LC3B應(yīng)用最為廣泛。在LC3合成后, LC3前體經(jīng)過Atg4在C段切割形成LC3-I, 并在C末端暴露出一個(gè)甘氨酸殘基。LC3-I與磷脂酰乙醇胺通過泛素樣酶促反應(yīng),形成膜結(jié)合型LC3-II[13]。Beclin1作為調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵基因, 可以與許多蛋白互作形成蛋白復(fù)合體,從而調(diào)節(jié)自噬小體的形成[6]; 同時(shí), 其他許多蛋白也可以與該復(fù)合體相互作用, 形成一個(gè)復(fù)雜的蛋白復(fù)合物, 從而調(diào)節(jié)自噬過程[14—16]。

圖5 Western blot檢測(cè)黃顙魚LC3和Beclin1組織分布Fig. 5 Western blot analysis of LC3 and Beclin1 in different tissue lysates

本研究首次對(duì)黃顙魚LC3B、Beclin1基因分別進(jìn)行原核表達(dá), 并制備多克隆抗體。本實(shí)驗(yàn)選擇含有T7啟動(dòng)子的pET32a(+)作為表達(dá)載體, 其可以充分利用大腸桿菌內(nèi)的資源用于表達(dá)目的蛋白[17]。經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后, 重組PfLC3B和PfBeclin1蛋白表達(dá)量均較高, 重組PfLC3B蛋白是以有活性的可溶性形式存在, 而重組PfBeclin1是以沒有活性的包涵體形式存在, 兩種形式的重組蛋白均具有較好的免疫原性。通過3次免疫Balb/C小鼠獲得的鼠源PfLC3B和PfBeclin1抗體分別可以特異性識(shí)別重組PfLC3B和PfBeclin1蛋白, 表明抗體制備成功。

黃顙魚LC3A基因編碼121個(gè)氨基酸,LC3B基因編碼123個(gè)氨基酸, 并且LC3A和LC3B氨基酸序列具有83%的同源性。類似于哺乳動(dòng)物, LC3A和LC3B均含有LC3家族的識(shí)別位點(diǎn), 由于制備抗體的抗原是重組黃顙魚LC3B全長蛋白, 理論上PfLC3B抗體可以與LC3A和LC3B發(fā)生交叉反應(yīng)。由于LC3家族的高保守性, LC3B抗體的交叉反應(yīng)在商品化抗體中也是普遍存在的, 例如, Zhong等[18]研究中的LC3B抗體(Cell Signaling, 3868S)可與其他LC3蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。本文中的LC3B抗體為多克隆抗體, 不是單克隆抗體, 故不一定是特異性的, 故不能排除制備的鼠源LC3B抗體與LC3A和LC3B發(fā)生交叉反應(yīng)的可能。Western blot檢測(cè)證明PfLC3B抗體能夠識(shí)別LC3-I和LC3-II兩種蛋白。Western blot檢測(cè)雷帕霉素處理的黃顙魚原代肝臟細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量明顯增加, 證明了自噬的發(fā)生。Western blot檢測(cè)證明PfBeclin1抗體能夠識(shí)別Beclin1蛋白, PfBeclin1蛋白表觀分子量為56 kD, 與預(yù)測(cè)分子量52 kD有一定偏差, 推測(cè)可能與蛋白修飾有關(guān)。

用鼠抗PfLC3B和PfBeclin1抗血清對(duì)黃顙魚腎臟、肝臟和脾臟組織進(jìn)行Western blot檢測(cè), LC3和Beclin1均在肝臟組織中有較高表達(dá), 在腎臟和脾臟總表達(dá)水平較低。肝臟中LC3主要以LC3-Ⅰ的形式存在, 腎臟和脾臟中未見明顯LC3目的條帶, 胞質(zhì)型LC3-Ⅰ在面臨應(yīng)激情況下轉(zhuǎn)化成膜型LC3-Ⅱ形成自噬體產(chǎn)生自噬, 肝臟中LC3-Ⅰ較腎臟和脾臟表達(dá)量較高, 我們推測(cè), 機(jī)體面臨應(yīng)激時(shí)肝臟中LC3-Ⅰ可以迅速向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化, 形成自噬體產(chǎn)生自噬以維持自身代謝穩(wěn)態(tài)。而肝臟中Beclin1蛋白表達(dá)較腎臟和脾臟高意味肝臟具有更強(qiáng)的自噬調(diào)節(jié)能力, 當(dāng)機(jī)體生存環(huán)境發(fā)生變化, 例如在饑餓等脅迫條件下, Bcl-2或Bcl-2XL從Beclin-1蛋白質(zhì)上解離下來, 從而迅速誘導(dǎo)自噬發(fā)生[16]。肝臟中的大量代謝過程與自噬有關(guān), 例如蛋白質(zhì)降解、脂肪代謝等,當(dāng)機(jī)體面臨生存環(huán)境脅迫時(shí), 例如饑餓等, 誘導(dǎo)肝臟自噬以維持自身代謝穩(wěn)態(tài)[19]。

本研究成功得到可溶性重組PfLC3B和PfBeclin1蛋白, 并采用弗氏佐劑作為免疫增強(qiáng)劑[20], 經(jīng)過3次免疫后獲得可以特異性識(shí)別重組PfLC3B和PfBeclin1蛋白的多克隆抗體, 鼠抗PfLC3B和PfBeclin1抗體可以分別特異性識(shí)別內(nèi)源性黃顙魚PfLC3和Beclin1蛋白, 為后續(xù)深入研究黃顙魚自噬的發(fā)生過程和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。