張 坤，王楷淇，張 靜，夏宇涵，杜寶萱，董 建

(山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016)

近年來，GQDs因其優(yōu)異的光化學(xué)特性、良好的生物相容性引起了人們的廣泛關(guān)注[1-2]。如何進(jìn)一步提高GQDs的量子產(chǎn)率及拓展其應(yīng)用領(lǐng)域是目前研究的熱點(diǎn)問題。雜原子摻雜[3]是調(diào)節(jié)GQDs熒光性質(zhì)，提高量子產(chǎn)率的有效方法，其中有關(guān)N-GQDs的研究最為廣泛[4-5]。N-GQDs作為一種新型熒光納米材料，在細(xì)胞成像、藥物傳輸、生物傳感等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

本論文以GQDs為碳源，三聚氰胺為氮源，采用高溫?zé)峤舛笙跛嵫趸姆椒ㄖ苽銷-GQDs，并對其微觀形貌和光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。在此基礎(chǔ)上，選用腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞對N-GQDs的細(xì)胞毒性和熒光成像性質(zhì)進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GQDs：自制，具體方法見文獻(xiàn)[2]；三聚氰胺：分析純，美國Sigma-Aldrich公司；硝酸、二甲亞砜(DMSO)：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；RPMI培養(yǎng)基：Hyclone公司；MTT，4%多聚甲醛、青鏈霉素混合液、胰酶-EDTA消化液：北京索萊寶科技有限公司；新生牛血清：浙江天橋生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

超聲波振蕩器：SB-12D型，寧波新藝超聲設(shè)備公司；真空干燥箱，DZF-6020，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高溫管式爐：GSL-1600x型，合肥科晶材料技術(shù)有限公司；冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ型，寧波新芝生物科技股份有限公司；紫外暗箱：ZF-20D型，鞏義市予華儀器有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱：3111型，Thermo Fisher Scientific公司；透射電子顯微鏡(TEM)：Tecnai G2 F20型，美國飛利浦公司；紫外分光光度計(jì)：U-3900型，日本Hitach公司；熒光分光光度計(jì)：F-4600型，日本Hitach公司；酶標(biāo)儀：Infinite M200型，德國Tecon公司；熒光倒置顯微鏡：GPJ9-TS100型，日本尼康公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 N-GQDs的制備

將50 mg GQDs超聲分散于100 mL去離子水中，然后加入0.25 g三聚氰胺，攪拌直至出現(xiàn)明顯的沉降。將上述混合體系蒸干，真空干燥24 h，研成粉末。將粉末置于石英舟內(nèi)，氬氣保護(hù)下750℃熱解45 min，然后用6 mol/L HNO3回流8 h，蒸干HNO3，透析純化得到N-GQDs。

2.2 N-GQDs的形貌及光學(xué)性質(zhì)表征

分別采用TEM、紫外分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)對N-GQDs的微觀形貌和光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征；以硫酸奎寧在0.1 mol/L H2SO4(Q = 0.54，340 nm) 為參照，按照下列公式計(jì)算N-GQDs的量子產(chǎn)率。其中Q：量子產(chǎn)率，I：熒光發(fā)射峰積分面積，n：折射率，A：吸光度，R：指參考樣品。

2.3 N-GQDs的細(xì)胞毒性測定

收集處于生長對數(shù)期的U251細(xì)胞，胰酶-EDTA消化后吹打得到細(xì)胞懸液(5×104個(gè)/mL)。將細(xì)胞懸液加入96孔板，放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的N-GQDs溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入20 μL MTT，孵育4 h后終止培養(yǎng)。每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩10 min。用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光值(A)，測定波長為490 nm。細(xì)胞存活率= (A-Ablank/Acontrol-Ablank) ×100%，其中Blank為空白組；Control為對照組。

2.4 N-GQDs的細(xì)胞成像研究

收集處于生長對數(shù)期的U251細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種至細(xì)胞爬片，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。繼續(xù)加入N-GQDs溶液(2.5 μg/mL)培養(yǎng)12 h，PBS沖洗3次。取出細(xì)胞爬片，加入4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS清洗3次。將細(xì)胞爬片轉(zhuǎn)移至載玻片上，封片固定。采用熒光倒置顯微鏡觀察N-GQDs的細(xì)胞成像。

3 結(jié)果與討論

3.1 N-GQDs的微觀形貌

N-GQDs的TEM照片及其粒徑分布如圖1(a)和(b)所示。本方法制備的N-GQDs具有良好的分散性，粒徑分布較為均勻，平均粒徑約為3.5 nm。

圖1 N-GQDs的TEM照片及其粒徑分布

3.2 N-GQDs的光學(xué)性質(zhì)

如圖2所示，N-GQDs的紫外-可見吸收光譜在266 nm處有一個(gè)明顯的肩峰，其歸因于C=O的n-π*躍遷。由熒光光譜可知，N-GQDs的最佳激發(fā)波長為360 nm，其發(fā)射峰位于442 nm處。當(dāng)激發(fā)波長由380 nm向480 nm轉(zhuǎn)變時(shí)，發(fā)射峰發(fā)生明顯的紅移。在365 nm紫外燈照射下，N-GQDs呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色熒光。N-GQDs的量子產(chǎn)率為15.8%，明顯高于GQDs(0.8%)。

圖2 N-GQDs的紫外-可見吸收光譜及熒光光譜圖

3.3 N-GQDs的細(xì)胞毒性

圖3 不同濃度N-GQDs孵育的U251細(xì)胞活力圖

要將N-GQDs應(yīng)用于生物成像領(lǐng)域，安全性是最基本的要求。由圖3可見，在N-GQDs的濃度≤120 μg/mL的情況下，U251細(xì)胞24 h后的存活率一直保持在90%以上，表明N-GQDs細(xì)胞毒性小，可保證其后續(xù)細(xì)胞成像的安全性。

3.4 N-GQDs的細(xì)胞熒光成像

將N-GQDs與U251細(xì)胞共同孵育12 h后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察。如圖4所示，N-GQDs可進(jìn)入U(xiǎn)251細(xì)胞，并呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光，這表明N-GQDs有望作為一種安全性較高的熒光標(biāo)記物，應(yīng)用于U251細(xì)胞成像。

圖4 N-GQDs孵育的U251細(xì)胞的熒光成像照片

4 結(jié)論

本研究以GQDs為碳源，三聚氰胺為氮源，采用高溫?zé)峤舛笙跛嵫趸姆椒ㄖ苽淞艘环N尺寸分布較為均勻的N-GQDs。與GQDs相比，N-GQDs的量子產(chǎn)率顯著增加。N-GQDs有望作為一種安全的熒光標(biāo)記物，應(yīng)用于U251細(xì)胞成像。