孫煥平，王 凱

1 前言

膽固醇作為兩類最主要的細胞脂質(zhì)物質(zhì)之一，是真核細胞細胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分。它是類固醇激素和膽汁酸的前體，是一種天然的生物活性劑，能夠作為信號分子參與多種細胞功能[1]。由于膽固醇對細胞的基本功能，當維持膽固醇穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)受到干擾會導(dǎo)致機體產(chǎn)生嚴重臨床病癥，如動脈粥樣硬化、肥胖癥和糖尿病等[2]。因此，機體調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)機制能夠平衡細胞內(nèi)和細胞膜水平的膽固醇水平，以適應(yīng)生理變化的需要。機體通過甾醇生物合成，脂蛋白攝取，脂肪分解動員固醇和內(nèi)流及外流的反饋調(diào)節(jié)，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平維持膽固醇穩(wěn)態(tài)[3]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs)是膽固醇穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄通路中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。SREBP有三種主要亞型；SREBP-1a和SREBP-1c來自SREBP1基因中染色體11上的兩個獨立啟動子，可產(chǎn)生獨特的5′非編碼區(qū)(5′UTR)氨基末端mRNA；SREBP-2來自SREBP2基因中染色體15上。SREBPs協(xié)調(diào)調(diào)控膽固醇和脂肪酸的生物合成，研究表明，SREBP-1c作為一種相對較弱的轉(zhuǎn)錄激活因子優(yōu)先參與脂肪酸代謝基因的激活，而SREBP-1a激活膽固醇和脂肪酸代謝基因；SREBP-2優(yōu)先激活膽固醇代謝的基因。

不同的SREBP亞型在轉(zhuǎn)錄水平上，通過不同的組織特異性信號傳導(dǎo)途徑進行獨立調(diào)節(jié)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上大約1100種氨基酸前體被表達。當細胞固醇水平較低時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)的SREBP前體形成復(fù)雜的SREBP裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein，SCAP)，并被轉(zhuǎn)運至高爾基體使氨基末端成熟的SREBP在其膜上被水解釋放。這些活性轉(zhuǎn)錄因子被轉(zhuǎn)運至細胞核，誘導(dǎo)核內(nèi)與膽固醇生物合成，脂蛋白攝取和脂肪分解相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄[4]。有研究表明，膽固醇水平能調(diào)控SREBP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的轉(zhuǎn)運，多不飽和脂肪酸等其他信號也能調(diào)節(jié)SREBP-1同系物的成熟[3]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一組內(nèi)源性的，由20-25個核苷酸非編碼組成的RNA，其能夠通過與自身目標mRNA的3′非編碼區(qū)(3′UTR)不完全堿基配對，來誘導(dǎo)靶基因的降解或是翻譯抑制，從而完成對蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)[4]。另有研究表明，miRNA也可以通過與其他區(qū)域(包括5′UTR或蛋白質(zhì)編碼的外顯子)結(jié)合抑制mRNA的靶標[5]。此外研究發(fā)現(xiàn)，單獨miRNA不僅可以在mRNA的3′UTR中配對多個靶點位，而且單獨mRNA也可被多個不同miRNA共同靶標，這表明miRNAs利用協(xié)同作用調(diào)控基因表達[6]?，F(xiàn)已證實miRNA調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因子，涉及miRNA表達水平的改變與膽固醇代謝紊亂高度相關(guān)[2]。位于SREBP內(nèi)含子中的miRNA有助于維持體內(nèi)膽固醇平衡，影響高密度脂蛋白(HDL)生命周期[6]，改善脂肪酸代謝和胰島素信號釋放[7]。因此，miRNAs轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用除了激活復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子外，還是維持細胞內(nèi)膽固醇代謝調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定的關(guān)鍵。

2 miRNA的生物合成及轉(zhuǎn)錄

miRNA在哺乳動物的生物合成中，大多數(shù)miRNA基因被RNA聚合酶II(RNA Pol II)轉(zhuǎn)錄生成長鏈的初級miRNA轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)，隨后被加帽聚腺苷酸化并剪接產(chǎn)生pre-miRNA[7]。另有一些miRNA也被RNA酶III(Pol III)轉(zhuǎn)錄[8]。然后核糖核酸酶Ⅲ(RNase-Ⅲ)Drosha瞬間將pri-miRNA中間體切割成包含約70-90個核苷酸的莖環(huán)狀pre-miRNA。緊接著由Ran-GTP 依賴性核轉(zhuǎn)運受體 Exportin5將pre-miRNA運送至細胞質(zhì)，并由細胞質(zhì)中Dicer酶進一步處理以產(chǎn)生成熟的miRNA，其長度約為22個核苷酸。成熟的miRNA與Argonaute家族蛋白(AGO)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)，RISC通過不完全堿基配對使mRNA的3'UTR與miRNA的“種子”區(qū)域特異性結(jié)合，最后增強mRNA翻轉(zhuǎn)和/或轉(zhuǎn)錄抑制[9]。

miRNA表達受到組織特異性和發(fā)育階段異性控制。大多數(shù)miRNA基因轉(zhuǎn)錄是由RNA Pol II介導(dǎo)的，他們的啟動子在蛋白質(zhì)基因編碼中被認為具有序列特征和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制[10]。事實上，高通量測序和生物信息學(xué)方法已經(jīng)揭示，miRNA基因近端上游區(qū)域具有TATA盒、啟動子元素、TFIIB識別元素(TFIIB recognition element，BRE)和大量轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序[11]。此外，最近的研究已經(jīng)預(yù)測miRNA啟動子區(qū)域接近轉(zhuǎn)錄起始位點，暗示表觀遺傳機制，如DNA甲基化和組蛋白修飾對miRNA表達調(diào)控的作用[12]。為了更好地理解miRNA基因的多樣性、功能和生物合成，需要關(guān)于替代、剪接啟動子和miRNA基因加工的更詳細信息。

3 miRNA在膽固醇生物合成中的作用

3.1 膽固醇平衡調(diào)節(jié)回路：SREBP和miRNAs

研究表明，miRNA 能夠直接或者間接影響相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白和催化酶的活性，參與膽固醇合成、運輸，在機體膽固醇穩(wěn)態(tài)維持過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[8，9]。

SREBP-1a和SREBP-1c參與脂肪酸和葡萄糖等能量代謝相關(guān)基因表達，而SREBP-2更具特異性的參與膽固醇代謝基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[3]。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白(sterol regulatory element binding proteins cleavage-activating protein,SCAP)是主要的膜上膽固醇傳感器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不活躍的SREBP前體能夠直接與SCAP交互作用。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜閾值水平高于5mol/%時，SCAP直接結(jié)合膽固醇，并維持與胰島素誘導(dǎo)基因(insulin induced gene，INSIG)結(jié)合的構(gòu)象，促使SREBP進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。然而，當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜膽固醇低于5%時，SCAP構(gòu)象發(fā)生改變，不再與INSIG相互作用。這使得SCAP與外被蛋白(coat protein Ⅱ，COP II)相互作用，將SCAP-SREBP復(fù)合物運送至高爾基體。進入高爾基體后，SREBP經(jīng)過位點1和位點2蛋白酶協(xié)同一致的兩步蛋白水解作用，釋放代表成熟轉(zhuǎn)錄因子的氨基區(qū)域并遷移至細胞核，激活SREBP靶基因的表達。細胞核內(nèi)SREBPs是不穩(wěn)定的，并能被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)通過靶向E3泛素連接酶F-box和F 框/WD-40 域蛋白 7(F-box and WD repeat domain-containing 7,Fbxw7)降解[4]。最近研究發(fā)現(xiàn)，小鼠和人類肝臟組織中miR-183、miR-96、miR-182操縱子被SREBP-2直接激活。SREBP-2與TSS附近的miR-183/96/182轉(zhuǎn)錄單元的保守結(jié)合位點相互作用，促進三個miRNA的多順反子轉(zhuǎn)錄。miR-182靶向FBXW7，miR-96靶向INSIG2，建立調(diào)節(jié)SREBP活性的正反饋回路，從而維持膽固醇穩(wěn)定[13, 14]。

另有研究表明，miR-24靶向INSIG1也會對SREBP水平產(chǎn)生積極影響[15]，但miR-24如何調(diào)控體內(nèi)SREBP平衡機制還有待確定。盡管如此，在飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中拮抗miR-24仍能通過下調(diào)脂質(zhì)基因表達，顯著降低血漿和肝臟脂質(zhì)水平。在非酒精性脂肪肝或脂肪性肝炎患者中也觀察到高水平的miR-24以及更低水平的INSIGI[16]，說明miR-24和INSIGI之間的作用可能參與調(diào)控代謝性疾病中脂質(zhì)平衡。

miR-185表達受SREBP-1c調(diào)控， SREBP-1c與miR-185的啟動子區(qū)域內(nèi)特定基序結(jié)合。在這種情況下，通過體內(nèi)和體外靶向SREBP-2的3′UTR導(dǎo)致膽固醇代謝基因功能失活，例如羥基-3-甲基戊二?；?CoA還原酶(HMGCR)和低密度脂蛋白受體(LDLR)的表達降低。脂肪酸是膽固醇酯合成原料，而SREBP-1c主要調(diào)節(jié)脂肪酸的產(chǎn)生。這表明SREBP-1c/miR-185軸構(gòu)成膽固醇代謝反饋通路，維持有力膽固醇和膽固醇酯的比值[17]。需要進一步的研究來了解miR-185在代謝性疾病中的生理作用。

3.2 膽固醇生物合成中的其他miRNA

在研究中抑制肝臟miR-122表達，導(dǎo)致小鼠血漿和肝臟的膽固醇和甘油三酯水平降低，表明miR-122對脂質(zhì)和脂肪酸氧化基因有重要影響。后續(xù)研究還顯示，減少miR-122可降低非人類靈長類游離膽固醇水平[18]。因此，miR-122被認為是潛在的新型降脂劑，提示它可能是一種治療靶點。然而，另一項研究顯示，在NASH患者中miR-122表達顯著下調(diào)，抑制miR-122促進了人肝臟細胞中脂肪酸和膽固醇合成基因的表達[19]。這些相互矛盾的研究很可能是由于miR-122是肝臟中表達最高的miRNA之一，能夠通過多種途徑對正常肝功能產(chǎn)生重要影響。

NASH患者肝臟中miR-34a水平升高，這與SREBP-2增加有關(guān)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可通過抑制SIRT1基因使SREBP-2穩(wěn)定[21]。Lee等人發(fā)現(xiàn)，法尼酯衍生物X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)通過激活轉(zhuǎn)錄抑制因子抑制miR-34a的表達，發(fā)揮調(diào)節(jié)SIRT1的功能。在非酒精性脂肪肝病中miR-34a和p53升高與SIRT1被抑制相關(guān)[22]。熊去氧膽酸是一種天然的膽汁酸，可通過激活膽汁酸受體FXR來降低脂毒性和NAFLD，Castro等人報道稱這可能是FXR對miR-34a/SIRT1/p53軸的影響[23]。因此，miR-34a的上調(diào)可能促進肝臟脂肪變性的發(fā)生和進展，這表明抗miR-34a化合物能夠有效治療NAFLD和NASH。

最近研究顯示，細胞膽固醇水平能夠增加miR-223轉(zhuǎn)錄水平。在人肝細胞系中過表達的miR-223通過降低清道夫受體(SR-BI)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a合酶(HMGCS1)活性，抑制膽固醇吸收和生物合成，并通過促進ABCA1基因表達提高膽固醇外流。此外，miR-223敲除小鼠通過誘導(dǎo)膽固醇生物合成基因(包括HMGCS1[24])，其血漿和肝臟表現(xiàn)出較高的膽固醇水平。這些結(jié)果表明，miR-223在調(diào)節(jié)全身膽固醇穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。

4 miRNA對膽固醇逆轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)

4.1 膽固醇外流與miRNA

除了生物合成外，調(diào)控過量膽固醇外流對維持膽固醇穩(wěn)態(tài)也是至關(guān)重要的。膽固醇轉(zhuǎn)運體，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1 (ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)促進膽固醇外流至細胞外受體，形成新生的高密度脂蛋白(HDL)顆粒。這個過程是膽固醇逆轉(zhuǎn)運(RCT)的第一步，多余的膽固醇從外周細胞轉(zhuǎn)運至肝臟，以便外排到膽汁和糞便中[25]。肝臟ABCA1失活會導(dǎo)致小鼠體內(nèi)總HDL-c嚴重減少[26]。由于血漿HDL-C水平與心血管疾病呈負相關(guān)，因此ABCA1介導(dǎo)的膽固醇流出對于維持膽固醇動態(tài)平衡和防止動脈粥樣硬化至關(guān)重要。最近的研究表明，幾種miRNA靶向ABCA1，從而調(diào)節(jié)血漿HDL-C水平。其中，位于SREBP-2基因內(nèi)含子內(nèi)的miR-33a研究最為廣泛。miR-33a和SREBP-2由于共同表達，協(xié)同調(diào)控膽固醇合成吸收和轉(zhuǎn)運，以維持細胞膽固醇穩(wěn)態(tài)[27]。此外，抑制miR-33能夠顯著增加肝臟ABCA1表達，進而增加小鼠體內(nèi)循環(huán)HDL-c水平[28]。miR-33a在物種間高度保守，而人類位于SREBP1基因內(nèi)含子中的miR-33b在嚙齒動物中不存在。由于胰島素抵抗引起的高胰島素血癥持續(xù)誘導(dǎo)SREBP-1c表達，人體在這種條件下miR-33b顯著增加。這說明脂質(zhì)生物合成調(diào)節(jié)異常和膽固醇流出可能導(dǎo)致高脂血癥和心血管疾病。事實上，在胰島素抵抗的非人類靈長類動物中miR-33b和SREBP-1c都顯著增加[29]，通過miR-33拮抗作用調(diào)控miR-33靶基因(如ABCA1)，能夠顯著減低VLDL并增加HDL。盡管拮抗劑對葡萄糖穩(wěn)態(tài)或胰島素敏感性的作用尚未觀察到，但這些結(jié)果表明miR-33a / b靶向治療人類代謝疾病的治療潛力。

肝X受體(Liver X receptor，LXR)是膽固醇代謝的主要調(diào)控因子，能夠激活A(yù)BCA1、ABCG1等多種參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運的基因[30]。最近的一項研究證明了這點，在巨噬細胞中miR-26被氧化甾醇激活，能夠靶向調(diào)控ABCA1和細胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白[31]。相反，在類似的條件下，miR-144被LXR上調(diào)，并靶向ABCA1，表明在膽固醇流出過程中存在負反饋調(diào)節(jié)[32]。通過靶向LXR的3'UTR，肝臟miR-613參與LXR自動的反饋調(diào)節(jié)循環(huán)。此外，激活核受體FXR能夠促進miR-144表達，同時控制膽汁酸合成、排出和運輸?shù)幕?。miR-144還抑制肝臟ABCA1并降低血漿HDL-C水平。使用FXR激動劑可增加肝臟SR-BI的表達，促進肝臟對HDL-c的吸收，提示FXR誘導(dǎo)的miR-144是RCT過程中將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁的有效補充途徑[33]。

4.2 HDL-c吸收與miRNA

肝臟和類固醇生成組織中SR-BI高度表達，能夠促使HDL-c釋放出膽固醇用于類固醇激素合成[34]。盡管血漿中低HDL-c水平是動脈粥樣硬化的標志，但是提高HDL-c的益處仍存在爭議。即便是在血漿HDL-c水平極低的情況下，小鼠肝臟SR-BI過表達同樣能夠降低動脈粥樣硬化程度。功能性獲得肝SR-BI可以選擇性增加HDL-c吸收，并增加殘留HDL顆粒的水平，這可能更有效的促進巨噬細胞中膽固醇外流，從而增加膽固醇外排至膽汁以及巨噬細胞膽固醇流出的總體速率。另一方面，敲除小鼠SR-BI基因?qū)е赂闻K分解HDL-c的代謝受損，HDL-c水平顯著升高，巨噬細胞RCT速率降低，小鼠更易受APOE- 或LDLR-缺陷引發(fā)的動脈粥樣硬化影響。這些結(jié)果表明，肝臟SR-BI可以影響RCT的總體速率，并且其表達的調(diào)控對于維持膽固醇穩(wěn)態(tài)具有重要意義。最近研究表明，人肝細胞系中miR-185、miR-96和miR-223都能夠抑制SR-BI和HDL-C攝取。在高脂飲食喂養(yǎng)APOE敲除小鼠中，其肝臟miR-96和miR-185表達顯著下調(diào)，而SR-BI表達增加，提示這兩種miRNA都可能調(diào)節(jié)血漿HDL-C水平和RCT[35]。此外，在高膽固醇喂養(yǎng)的小鼠肝臟中miR-96也顯著下調(diào)，從而抑制SREBP-2降低膽固醇合成[36]。因此，通過抑制miR-96能夠阻礙膽固醇合成并激活RCT，從而逆轉(zhuǎn)動脈粥樣硬化的進展。

5 展望

綜上所述，miRNA通過調(diào)節(jié)膽固醇生物合成、脂蛋白攝取、CRT等系統(tǒng)地維持體內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)。因此，miRNA表達失調(diào)可能是引發(fā)膽固醇代謝紊亂的發(fā)病機制。事實上，研究已經(jīng)證明，體內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)是通過轉(zhuǎn)錄因子和miRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)維持。SREBPs、LXR和FXR等細胞內(nèi)甾醇傳感器已被鑒定為直接調(diào)節(jié)miRNA轉(zhuǎn)錄的因子，通過參與反饋或前反饋調(diào)節(jié)回路維持膽固醇穩(wěn)態(tài)。了解轉(zhuǎn)錄因子和miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將揭示機體復(fù)雜的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制，對代謝性疾病的治療提供堅實的理論支持。