王玲玉 譚濤 陳偉燕

[摘要] 目的 探討金匱腎氣丸對于糖尿病復(fù)合腦缺血模型大鼠認(rèn)知功能的影響及其機(jī)制。 方法 將SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組和模型組。正常對照組用普通基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)，模型組用高脂高糖飼料飼養(yǎng)，30 d后建立2型糖尿病胰島素抵抗大鼠，對糖尿病大鼠施以雙側(cè)頸動脈缺血再灌手術(shù)誘導(dǎo)糖尿病腦病模型。將模型組大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組、金匱腎氣丸組及二甲雙胍組，采用Morris水迷宮實驗對動物行為學(xué)進(jìn)行評價，處死大鼠后取腦海馬組織，采用Western blot法檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元Ng和mGluR5蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 水迷宮實驗結(jié)果顯示，與糖尿病模型組比較，金匱腎氣丸組及二甲雙胍組大鼠逃避潛伏期和探索距離縮短（P<0.05或P<0.01），目標(biāo)象限游泳時間顯著延長，站臺穿越次數(shù)顯著增加（P<0.05）;大鼠海馬神經(jīng)元中Ng和mGluR5蛋白表達(dá)恢復(fù)，并且呈劑量依賴性。 結(jié)論 金匱腎氣丸可明顯改善糖尿病腦病模型大鼠認(rèn)知障礙，并增強其大腦海馬區(qū)Ng和mGluR5蛋白表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病腦病;金匱腎氣丸;Ng;mGluR5

[中圖分類號] R285.5 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）24-0037-04

[Abstract] Objective To explore the effects of Jingui Shenqi Wan on cognitive dysfunction and its mechanism in rats with diabetes mellitus combined with cerebral ischemia. Methods SD rats were randomly divided into normal control group and model group. The normal control group was fed with normal basal diet， the model group was fed with high-fat and high-sugar diet， and the insulin-resistant rats with type 2 diabetes were established 30 days later. Diabetic encephalopathy models were induced by bilateral carotid ischemia-reperfusion surgery in diabetic rats. Rats in the model group were randomly divided into the diabetic model group， the Jingui Shenqi Wan group and the metformin group. Morris water maze test was used to evaluate the behavior of the rats. The rats were sacrificed and the hippocampus was taken. The expression of Ng and mGluR5 protein in hippocampal neurons of each group was detected by Western blot. Results The results of the water maze test showed that compared with the diabetic model group， the escape latency and exploration distance（P<0.05 or P<0.01） of the Jingui Shenqi Wan group and the metformin group were shortened， the target quadrant swimming time was significantly prolonged and the number of increased station crossings was significantly increased（P<0.05）; The Ng and mGluR5 protein expression was restored in rats' hippocampal neurons in a dose-dependent manner. Conclusion Jingui Shenqi Wan can significantly improve the cognitive impairment of diabetic encephalopathy model rats and enhance the expression of Ng and mGluR5 protein in hippocampus of the brain.

[Key words] Diabetic encephalopathy; Jingui Shenqi Wan; Ng; mGluR5

糖尿病腦病是糖尿病晚期比較常見的合并癥，其發(fā)生機(jī)制可能與長期高血糖刺激引起腦神經(jīng)細(xì)胞加速老化相關(guān)，該類疾病主要臨床癥狀為認(rèn)知功能障礙，包括智力減退、健忘、反應(yīng)遲鈍等，同時也會出現(xiàn)腦組織形態(tài)異常等病理學(xué)改變[1]。目前該病沒有較為有效的治療手段，主要是在控制患者血糖水平的基礎(chǔ)上配合使用腦血管擴(kuò)張劑，如尼莫地平等以及一些神經(jīng)營養(yǎng)劑[2]，但其效果并不明顯，故尋求其他安全有效的藥物具有現(xiàn)實意義。近年來，中醫(yī)藥治療糖尿病腦病取得了長足的進(jìn)展，尤其是金匱腎氣丸在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面均有明顯療效[3，4]，但是其具體機(jī)制研究尚少，故本實驗擬從金匱腎氣丸對糖尿病腦病干預(yù)作用入手，進(jìn)一步探討糖尿病腦病的治療作用及其發(fā)病機(jī)制，為糖尿病腦病治療提供新方案和理論思路。

1 材料與方法

1.1 一般材料

2016年3月16日～12月27日進(jìn)行實驗，鏈脲佐菌素（Sigma公司，美國，批號2060675），金匱腎氣丸（北京同仁堂，國藥準(zhǔn)字Z11020147，規(guī)格20 g/100粒），二甲雙胍緩釋片（成都恒瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20030952，規(guī)格0.5 g×10片/盒）。健康雄性SD大鼠由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，Ng、mGluR5和β-actin一抗抗體及其相應(yīng)二抗均購自Santa Cruz公司，實驗所需的各項儀器和設(shè)備則由浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 模型制備及分組

將32 只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組（n=8）和模型組（n=24）。正常組僅普通基礎(chǔ)飼料喂食，自由攝食飲水;模型組則以高脂高糖飼料喂食（高脂配方：基礎(chǔ)飼料65%、豬油10%、蛋黃粉10%、全脂奶粉10%、蔗糖5%），自由攝食飲水;造模30 d后禁食12 h，模型組大鼠按50 mg/kg體重左下腹腔注射鏈脲佐菌素，正常組大鼠按同劑量左下腹腔注射檸檬酸鹽緩沖液。造模7 d后，大鼠尾靜脈取微量血，用強生公司One-Touch Ultra血糖儀檢測血糖，尿糖以試紙檢測定性。當(dāng)血糖>16.7 mmol/L合并尿糖（+++）為糖尿病大鼠模型造模成功，造模4 d后行雙側(cè)頸動脈缺血再灌注手術(shù)復(fù)合造模，將大鼠麻醉后分離出頸總動脈用動脈夾夾閉15 min，放開5 min，再夾15 min后放開，局部給予青霉素后縫合皮膚。造模成功后，模型組大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組、金匱腎氣丸組及二甲雙胍組，每組8只。金匱腎氣丸組以金匱腎氣丸1.25 g干粉/mL水配置后，10 mL/kg每天給大鼠灌胃1次，二甲雙胍組以二甲雙胍緩釋片2.0 g干粉/mL溶于水，10 mL/kg每天給大鼠灌胃1次，均灌胃治療30 d。剔除及納入標(biāo)準(zhǔn)：動物蘇醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評分，按照Zausinger六分法[5]對其神經(jīng)功能進(jìn)行評分，根據(jù)評分結(jié)果進(jìn)行下一步實驗。去除無神經(jīng)功能缺損及病情過輕和過重的模型，即評分為 0、4 和 5 分的大鼠，評分為 1、2、3 分的均視為模型成功。

1.3 Morris水迷宮實驗

主要由圓形水池和自動攝象及電腦分析系統(tǒng)組成Morris水迷宮測定大鼠記憶功能：①定位航行實驗：每組大鼠灌胃1 h后開始，每天分為上午和下午2個時段，每個時段分別訓(xùn)練4次，每次從4 個不同的標(biāo)記點（標(biāo)記點平均分布于4個象限），將各組大鼠面朝池壁置于水中，分別記錄其在90 s 內(nèi)尋找到平臺所需的時間（即逃避潛伏期）和搜索距離。每次訓(xùn)練間隔30 min，共訓(xùn)練4 d，保持平臺位置不變。如果90 s內(nèi)仍未尋找到平臺，則將大鼠重新置于平臺，并于20 s后移出迷宮，其潛伏期計為90 s。②空間探索實驗：4 d后撤除平臺，將大鼠任選1個入水點面向池壁置于水中，記錄在90 s內(nèi)大鼠穿越虛擬平臺的次數(shù)及其在目標(biāo)象限（原站臺象限）的游泳時間。

1.4 Western blot法檢測Ng和mGluR5蛋白表達(dá)

取下各組大鼠海馬腦組織，提取蛋白質(zhì)電泳后轉(zhuǎn)膜，先將膜與一抗4℃孵育過夜，后在室溫下與二抗孵育1～2 h，TBST洗后發(fā)光顯影，以β-actin為內(nèi)參，一抗?jié)舛确謩e為Ng（1∶500）、mGluR5（1∶500）、β-actin（1∶1000）;二抗?jié)舛龋?∶1000）。結(jié)果通過Image J軟件測定灰度值，并分別計算Ng或mGluR5蛋白表達(dá)灰度值= Ng或mGluR5灰度值/對應(yīng)β-actin灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理分析數(shù)據(jù)，計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用方差齊性檢驗，或采用重復(fù)測量方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金匱腎氣丸對糖尿病復(fù)合腦缺血模型大鼠潛伏期的影響

Morris水迷宮結(jié)果顯示，糖尿病復(fù)合腦缺血模型組大鼠尋找以及到達(dá)站臺的游動時間（即逃避潛伏期）較正常組大鼠明顯增加，而金匱腎氣丸組及二甲雙胍組大鼠則均較糖尿病模型組改善，且隨著時間推移，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表1。

2.2 金匱腎氣丸對糖尿病復(fù)合腦缺血模型大鼠水迷宮試驗的影響

與正常組相比，糖尿病模型組大鼠探索距離增長，而在目標(biāo)象限（Ⅱ象限）的游泳時間變短，站臺穿越次數(shù)減少;但經(jīng)金匱腎氣丸及二甲雙胍治療后大鼠探索距離、目標(biāo)象限（Ⅱ象限）游泳時間及站臺穿越次數(shù)均有明顯恢復(fù)（P<0.05或P<0.01），見表2。

2.3 金匱腎氣丸對糖尿病復(fù)合腦缺血模型大鼠腦海馬組織中Ng和mGluR5蛋白表達(dá)影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，糖尿病模型組大鼠海馬中Ng和mGluR5蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01）;而金匱腎氣丸組及二甲雙胍組大鼠海馬組織Ng和mGluR5蛋白表達(dá)與糖尿病模型組比較，有明顯增高（P<0.05），見表3及圖1～3。

3 討論

糖尿病作為現(xiàn)在常見多發(fā)性疾病，其并發(fā)癥是患者最主要的死亡原因，并逐漸引起關(guān)注。臨床及動物研究均已證實，糖尿病可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，患者常出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力減退，最終導(dǎo)致糖尿病人群在老年癡呆的發(fā)病率顯著高于其他人群[6，7]。糖尿病腦病作為糖尿病主要并發(fā)癥之一，嚴(yán)重危害患者健康，但卻缺乏有效的防治手段[8，9]。糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”范疇，氣血陰陽失衡，變證百出，益氣養(yǎng)陰是該病最基本的治療方法[10，11]。金匱腎氣丸可溫腎陽、滋腎陰，取其陰中求陽之法，以山藥厚其土以藏之，山茱萸肉斂其氣以秘之，牡丹皮、澤瀉和茯苓則引亢火以歸之。如此可使腎復(fù)其封蟄之職，水中之火，緩緩蒸騰，不亢不衰，溫養(yǎng)五臟六腑及四肢百骸，終成水火既濟(jì)之象[12，13]。

目前關(guān)于糖尿病腦病發(fā)病機(jī)制的研究較少，推測可能與海馬神經(jīng)元相關(guān)蛋白表達(dá)失調(diào)有關(guān)。海馬作為主導(dǎo)學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵部位，其長時程增強（LTP）是重要的作用基礎(chǔ)，該作用依賴于復(fù)雜的突觸前、后機(jī)制，LTP高頻刺激后可引起胞內(nèi)蛋白激酶C（PKC）等的表達(dá)[14]，而Ng作為一種新發(fā)現(xiàn)的腦特異性突觸后蛋白，是PKC的天然作用底物[15]。Ng在生理狀態(tài)下主要與CaM結(jié)合形成復(fù)合體，但PKC可使該復(fù)合物發(fā)生磷酸化、氧化及谷胱甘肽化等化學(xué)修飾，參與學(xué)習(xí)記憶功能和LTP等突觸可塑性機(jī)制，因而可能在學(xué)習(xí)記憶的形成和鞏固中發(fā)揮重要作用[16]。此外mGluR5作為主要分布于皮層、紋狀體及海馬等突觸后膜的神經(jīng)遞質(zhì)，可以通過調(diào)節(jié)突觸后膜釋放谷氨酸和多巴胺，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)神經(jīng)通路活性[17]，并與學(xué)習(xí)記憶也密切相關(guān)[18]。有實驗證實，如往大鼠腦室內(nèi)注射mGluR5阻滯劑可導(dǎo)致海馬長時程增強（LTP）抑制的發(fā)生，并同時損害大鼠空間記憶水平[19]，而通過腹腔注射mGluR5變構(gòu)增強劑則可顯著改善海馬相關(guān)的空間記憶[20]，并證實大鼠記憶水平情況與其海馬mGluR5的蛋白表達(dá)水平存在正相關(guān)[21]。

本實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠游出時間和錯誤次數(shù)均明顯增多，提示糖尿病復(fù)合腦缺血模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能減退，該病可造成大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中Ng和mGluR5表達(dá)顯著下降，可能也是該病引起認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵途徑。而經(jīng)過金匱腎氣丸及二甲雙胍治療后的大鼠，其海馬神經(jīng)元細(xì)胞中Ng和mGluR5表達(dá)明顯回升，潛伏期及錯誤次數(shù)均有顯著改善，提示金匱腎氣丸對糖尿病復(fù)合腦缺血模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶有明顯改善作用，其機(jī)制可能是通過恢復(fù)海馬神經(jīng)元細(xì)胞中Ng和mGluR5的表達(dá)來實現(xiàn)的。

[參考文獻(xiàn)]

[1] WH Gispen，GJ Biessels. Cognition and synaptic plasticity in diabetes mellitus[J]. Trends in Neurosciences，2000，23（11）：542-549.

[2] K ？覵abuzek，D Suchy，B Gabryel，et al. Quantification of metformin by the HPLC method in brain regions，cerebrospinal fluid and plasma of rats treated with lipopolysaccharide[J]. Pharmacological Reports，2010， 62（5）：956-965.

[3] 葉正芹，吳學(xué)蘇，官艷華，等. 中西醫(yī)結(jié)合治療對新診斷2型糖尿?。怅巸商撟C）炎癥因子的影響[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2018，56（18）：115-122.

[4] 郭玉婷. 格列美脲聯(lián)合金匱腎氣丸治療糖尿病的臨床療效分析[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，19（21）：110-111.

[5] Zausinger S，Westeraier T，Plesnila N，et al. Neuroprotection in transient focal cerebral ischemia by combination drug therapy and mild hypothermia：comparison with customary therapeutic regimen[J]. Stroke，2003，34（6）：1526-1532.

[6] Fagot-Campagna A，Bourdel-Marchasson I，Simon D. Burden of diabetes in an aging population：prevalence，incidence，mortality，characteristics and quality of care[J]. Diabetes Metab，2005，2（5）：35-52.

[7] G Roglic，A Green，R Sicree，et al. Global prevalence of diabetes：Estimates for the year 2000 and projections for 2030[J]. Diabetes Care，2004，27（5）：1047-1053.

[8] GJ Biessels，S Staekenborg，E Brunner，et al. Risk of dementia in diabetes mellitus：a systematic review[J]. The Lancet Neurology，2006， 5（1）：64-74.

[9] 盛樹力. 糖尿病腦病與老年性癡呆[J]. 中華內(nèi)分泌代謝雜志，2001，17（2）：58-59.

[10] 史雅瓊，馬建偉. 2型糖尿病患者中醫(yī)證型分布及其并發(fā)癥型特點[J]. 河南中醫(yī)，2017，37（10）：1789-1791.

[11] 汪悅，黃瑜，周欣. 金匱腎氣丸對雄性2型糖尿病大鼠睪酮與一氧化氮的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（3）：471.

[12] 王澤軍. 金匱腎氣丸對2型糖尿病的療效分析[J]. 中醫(yī)臨床研究，2013，5（7）：66-67.

[13] Huang J，Hu X，Lu L，et al. Electrical regulation of Schwann cells using conductive polypyrrole/chitosan polymers[J]. J Biomed Mater Res，2010，93（1）：164-174.

[14] Neuner-Jehle M，Rhyner TA，Borbely AA. Sleep deprivation differentially alters the mRNA and protein levels of neurogranin in rat brain[J]. Brain Res，1995，685（1）：143-153.

[15] Fedorov NB，Pasinelli P，Oestreicher AB，et al. Antibodies to postsynaptic PKC substrate neurogranin prevent long-term potentiation in hippocampal CA1 neurons[J]. Eur J Neurosci，1995，7（4）：819-822.

[16] Neyman S，Manahan-Vaughan D. Metabotropic glutamate receptor 1（mGluR1）and 5（mGluR5）regulate late phases of LTP and LTD in the hippocampal CA1 region in vitro[J].Eur J Neurosci，2008，27（6）：1345-1352.

[17] Manahan-Vaughan D，Braunewell KH. The metabotropic glutamate receptor，mGluR5，is a key determinant of good and bad spatial learning performance and hippocampal synaptic plasticity[J]. Cereb Cortex，2005，15（11）：1703-1713.

[18] Naie K，Manahan-Vaughan D. Regulation by metabotropic glutamate receptor 5 of LTP in the dentate gyrus of freely moving rats：Relevance for learning and memory formation[J]. Cereb Cortex，2004，14（2）：189-198.

[19] Balschun D，Zuschratter W，Wetzel W. Allosteric enhancement of metabotropic glutamate receptor 5 function promotes spatial memory[J]. Neuroscience，2006，142（3）：691-702.

[20] Balschun D，Wetzel W. Inhibition of mGluR5 blocks hippocampal LTP in vivo and spatial learning in rats[J]. Pharmacol Biochem Behav，2002，73（2）：375-380.

（收稿日期：2018-09-14）