賈如 衣穎杰 劉潔

[摘要]目的：探討不同大小的動(dòng)態(tài)載荷下人牙周膜細(xì)胞（hPDLCs）中線粒體發(fā)育和功能水平的變化。方法：體外分離因正畸治療需要而拔除的健康前磨牙的牙周膜組織，培養(yǎng)健康的hPDLCs。利用動(dòng)態(tài)流體靜壓加力裝置加載0～50kPa、0～90kPa、0～150kPa的周期性動(dòng)態(tài)壓應(yīng)力1d，3d，5d。采用MTT檢測其對細(xì)胞增殖活性的影響，采用實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測線粒體發(fā)育及功能相關(guān)基因的RNA表達(dá)水平。結(jié)果：與未受力組細(xì)胞相比，0～50kPa、0～90kPa組hPDLCs中線粒體發(fā)育相關(guān)基因PGC-1α、TFAM、NRF1及線粒體功能相關(guān)基因Cox7a1、Cox8b RNA表達(dá)水平增加，而0～150kPa組hPDLCs中以上線粒體發(fā)育及功能相關(guān)基因RNA表達(dá)水平則顯著降低。結(jié)論：適當(dāng)?shù)臋C(jī)械應(yīng)力刺激條件能增加人牙周膜細(xì)胞中線粒體發(fā)育水平并促進(jìn)其功能，而過大載荷則會抑制線粒體的發(fā)育及生理功能的發(fā)揮。

[關(guān)鍵詞]人牙周膜細(xì)胞;周期性應(yīng)力;動(dòng)態(tài)流體靜壓加力裝置;線粒體發(fā)育;線粒體功能;氧化應(yīng)激

[中圖分類號]R329.2 ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2019）11-0086-04

Abstract： Objective ?To investigate the changes of mitochondrial development and function in human periodontal ligament cells （hPDLCs） under different dynamic loads. Methods ?The periodontal ligament tissues of healthy premolars extracted for orthodontic treatment were isolated in vitro， and healthy hPDLCs were cultured. Cyclic dynamic compressive stresses of 0-50kPa， 0-90kPa and 0-150kPa were loaded by dynamic hydrostatic pressure device for 1， 3 and 5 days. MTT was used to detect its effect on cell activity， and real-time quantitative PCR was used to detect the expression level of mitochondrial development and function-related genes. Results ?Compared with the cells in the non-stressed group， the expression levels of mitochondrial development genes PGC-1α， TFAM， NRF1 and mitochondrial function-related genes Cox7a1 and Cox8b increased in the 0-50kPa and 0-90kPa groups， while the expression levels of mitochondrial development and function-related genes decreased significantly in the 0-150kPa groups. Conclusion ?Proper mechanical stress stimulation can increase the level of mitochondrial development and promote its function in human periodontal ligament cells， while excessive loading can inhibit the development and physiological function of mitochondria.

Key words： hPDLCs; dynamic loads; dynamic hydrostatic pressure device; mitochondrial development; mitochondrial function; oxidative stress

機(jī)械刺激是影響牙周支持組織代謝的重要調(diào)控因子，適度的牽張應(yīng)力刺激可以刺激骨組織自身的生長并進(jìn)行重建，達(dá)到骨代謝平衡的目的[1-2]。機(jī)械刺激作用的口腔靶組織-牙周膜是牙周支持組織中最為重要的組成部分之一。臨床中的應(yīng)力刺激通過牙體硬組織傳導(dǎo)到牙周膜組織后，人牙周膜細(xì)胞（Human periodontal ligament cells，hPDLCs）感知疼痛壓力并調(diào)整肌肉關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)，而其分泌功能也發(fā)生改變，進(jìn)而引起牙骨質(zhì)及牙槽骨的吸收或重建[3-4]。適當(dāng)?shù)臋C(jī)械負(fù)載力對牙周組織是一種功能刺激。但過大的機(jī)械刺激則可能會引起牙槽骨的破壞吸收以及創(chuàng)傷性牙周炎的發(fā)生。近年來，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥、牙周炎和許多全身性疾病都有顯著相關(guān)性，并提出了這些疾病可能的共同發(fā)病機(jī)制-氧化應(yīng)激[5-6]。而線粒體作為細(xì)胞能量代謝的場所，其氧化磷酸化是活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的重要來源。線粒體活性氧通過改變氧化還原反應(yīng)的狀態(tài)來調(diào)節(jié)信號，從而決定干細(xì)胞的自我更新和分化[7]，過量的ROS會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞線粒體的呼吸鏈，引起線粒體功能障礙[8-9]。

然而，目前關(guān)于hPDLCs在不同大小的動(dòng)態(tài)載荷下的氧化應(yīng)激狀態(tài)及其機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。本研究分離培養(yǎng)了健康hPDLCs，探討不同大小的機(jī)械應(yīng)力刺激對hPDLCs氧化應(yīng)激及線粒體發(fā)育與功能的影響，以期更好地抵抗機(jī)械應(yīng)力刺激下的氧化應(yīng)激，從而有益于牙周組織的健康。

1 ?材料和方法

1.1 材料：胎牛血清（美國，Gibco），α-MEM培養(yǎng)基（美國，Hyclone），I型膠原酶（美國，Sigma），0.25%胰蛋白酶（美國，Sigma），青、鏈霉素（美國， Sigma）， DMSO（美國，Sigma），RNA抽提試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本，TAKARA），q-RTPCR引物（北京奧科生物技術(shù)有限公司），syber Green熒光定量PCR檢測試劑盒（日本，TAKARA）。

1.2 樣本收集與細(xì)胞分離培養(yǎng)：所有hPDLCs來源的牙齒樣本來源均采集于西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院牙槽外科就診患者因正畸需要減數(shù)拔除的健康前磨牙，患者知情同意?；颊吆Y選標(biāo)準(zhǔn)為：無高血壓、心臟病等全身系統(tǒng)疾病，無肝炎等傳染性疾病;年齡16～30歲;患牙無齲、牙髓炎、根尖周炎、牙周炎等牙體及牙周相關(guān)疾病。

在超凈工作臺內(nèi)，用PBS溶液完善沖洗牙冠及牙根。刮取根中1/3的牙周膜，剪切成小于1mm3的組織塊，采用組織塊酶消化法培養(yǎng)原代細(xì)胞，培養(yǎng)約3～7d后細(xì)胞從組織中爬出，當(dāng)細(xì)胞增殖至培養(yǎng)瓶底壁約70%時(shí)，將傳代的細(xì)胞接種于新培養(yǎng)瓶，記為第一代hPDLCs，采用第4代hPDLCs用于實(shí)驗(yàn)研究。參照以往研究進(jìn)行hPDLCs的細(xì)胞標(biāo)志物與生物學(xué)特性檢測[10]。

1.3 動(dòng)態(tài)載荷實(shí)驗(yàn)：取第4代hPDLCs以1×105/ml細(xì)胞密度接種。采用動(dòng)態(tài)流體靜壓加力裝置[11]，通入5%CO2，5%O2，90%N2，分別施加頻率為0.1Hz，壓強(qiáng)為0～150kPa、0～90kPa、0～50kPa的周期性動(dòng)態(tài)壓應(yīng)力，余下1組放入加力艙，但不施加動(dòng)態(tài)壓力，作為空白對照，加力時(shí)間為每24h加力1h，共計(jì)加力5d。

1.4 MTT檢測：在加力實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第1、3、5天后，向每孔內(nèi)加入20μl預(yù)配制的MTT溶液，4h后棄去上清，每孔加入150μl DMSO，37℃避光振蕩10min，酶標(biāo)儀上490nm下讀數(shù)，檢測各孔吸光度并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 總RNA提取及cDNA合成：選擇第4代hPDLCs消化重懸，用Trizol裂解細(xì)胞并提取總RNA。利用Nano Drop微量紫外分光光度計(jì)檢測所提取RNA的純度和濃度。用RR036a逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測：使用Real-time PCR試劑盒按照RR820說明書配制反應(yīng)液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀上設(shè)置工作程序：預(yù)變性階段為95℃，30s;PCR反應(yīng)階段為（95℃ 5s，60℃ 34s）×40循環(huán)后停止，所用體系為20μl。引物設(shè)計(jì)序列如下：PGC-lα（Forward：5-TCTGAGTCTGTATGGAGTG ACAT-3，Reverse：5-CCAAGTCGTTCACATCTAGTTCA-3）;TFAM（Forward：5-CCAAAAAGAC CTCGTTCAGC-3，Reverse：5-ATGTCTCCGGATCGTTTCA C-3）;NRF1（Forward：5'-CCACGTTACAGGGAGGTGAG-3，Reverse：5-TGTAG CTCCCTGCTGCATCT-3）;Cox7a1（Forward：5-CGAGAACCGAGTAGCTGAG AA-3，Reverse：5-ATACAGGATGTTGTCTGTTGTCTGTTGCAC-3）;Cox8b（For ward：5-CCTAAGGCACACATCACTGC-3，Reverse：5-AACGTCACAGAGAGC CCAAT-3）;GAPDH（Forward：5-GTCTTCACCACCATGGAGAA-3，Reverse：5-ATCCACAG TCTTCTG GGTGG-3）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本論文中所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對不同加力組與空白對照組的數(shù)據(jù)采用LSD方差分析，數(shù)據(jù)均表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s），以P<0.05記為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 不同大小動(dòng)態(tài)載荷對牙周膜細(xì)胞增殖活性的影響：MTT結(jié)果顯示，在0～150kPa、0～90kPa和0～50kPa的周期性動(dòng)態(tài)壓應(yīng)力作用1d、3d和5d后，各加力組牙周膜細(xì)胞存活率較空白對照組無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。因此可以認(rèn)為0～150kPa、0～90kPa和0～50kPa的周期性動(dòng)態(tài)壓應(yīng)力作用對hPDLCs細(xì)胞增殖活性無明顯抑制作用，且不同加力時(shí)間點(diǎn)之間的細(xì)胞存活率也沒有顯著差異，說明在此范圍內(nèi)的加力時(shí)間對于hPDLCs細(xì)胞增殖活性也無明顯影響。見圖1。

2.2 不同大小動(dòng)態(tài)載荷對牙周膜細(xì)胞線粒體發(fā)育的影響：Real-time PCR結(jié)果顯示，在不同大小的周期性動(dòng)態(tài)壓應(yīng)力作用下，牙周膜細(xì)胞中線粒體發(fā)育相關(guān)基因的RNA表達(dá)水平并不一致。其中，在0～50kPa及0～90kPa應(yīng)力作用下，線粒體發(fā)育標(biāo)志基因PGC-1α、TFAM及NRF-1均出現(xiàn)隨壓應(yīng)力值升高而表達(dá)量逐漸增加的趨勢，但差異未見顯著性意義;但在0～150kPa的過大壓應(yīng)力作用下，以上線粒體發(fā)育標(biāo)志基因的表達(dá)量均出現(xiàn)顯著降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明過大咬合力作用會抑制牙周膜細(xì)胞線粒體的發(fā)育狀況。見圖2。

2.3 不同大小動(dòng)態(tài)載荷對牙周膜細(xì)胞線粒體功能的影響：Real-time PCR結(jié)果顯示，在不同大小的周期性動(dòng)態(tài)壓應(yīng)力作用下，牙周膜細(xì)胞中線粒體功能相關(guān)基因的RNA表達(dá)水平并不一致。其中，線粒體功能標(biāo)志基因Cox7a1在0～50kPa及0～90kPa應(yīng)力作用下出現(xiàn)隨壓應(yīng)力值升高而表達(dá)量逐漸增加的趨勢，并且在0～90kPa時(shí)表達(dá)量增高達(dá)顯著性差異;但在0～150kPa的過大壓應(yīng)力作用下，其表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而另一線粒體功能標(biāo)志基因Cox8b在不同大小的動(dòng)態(tài)壓應(yīng)力作用下表達(dá)量并未出現(xiàn)明顯差異。以上結(jié)果表明，表明過大咬合力作用會影響牙周膜細(xì)胞線粒體部分正常生理功能的發(fā)揮。見圖3。

3 ?討論

牙周膜連接牙槽骨和牙骨質(zhì)，為口內(nèi)牙齒咀嚼力的主要承擔(dān)組織。為了便于對牙周膜的生物性能、藥物反應(yīng)、力學(xué)及骨代謝相關(guān)方面的研究，很多學(xué)者對牙周膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)進(jìn)行了深入的探索。其中將刮取的牙周膜直接貼壁培養(yǎng)的組織塊法、胰酶消化重懸細(xì)胞的酶解法以及集兩者大成的組織塊酶解法，已經(jīng)成為現(xiàn)在體外hPDLCs原代培養(yǎng)的常規(guī)方式[12]。

在生理情況下，牙周膜可以承擔(dān)一定的咀嚼壓力，并保持成骨和破骨的相對穩(wěn)態(tài)。因此在體外牙周膜領(lǐng)域的研究中，探索其受力后生物行為的改變是其重要的研究方向。其中如何在體外對牙周膜細(xì)胞實(shí)現(xiàn)精確加力，從而建立牙周膜細(xì)胞仿生受力模型，一直是學(xué)者們研究的重點(diǎn)。根據(jù)加力方式的不同，不同學(xué)者選擇的加力大小也存在著很大差異。有學(xué)者通過聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）膜構(gòu)建三維牙周膜模型，對細(xì)胞施加6h的35g/cm2（g/cm2非壓強(qiáng)單位，如按1g重物施加于1cm2的平面計(jì)算，其施加壓強(qiáng)約為9.8Pa）靜態(tài)重物壓力后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性受到顯著抑制，而施加6～72h的25g/cm2靜物壓力后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力較不加力對照組明顯增強(qiáng)，且破骨細(xì)胞的潛在誘導(dǎo)因子PTHrP、IL-11、IL-8和FGF-2等表達(dá)也較不加力組明顯增加[13]。另有學(xué)者通過自研的可施加最大300psi（1psi≈6.875kPa）壓強(qiáng)的流體靜壓加載裝置對牙周膜細(xì)胞施加150psi的動(dòng)態(tài)壓力，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了跨膜蛋白家族和一些膠原的表達(dá)水平的變化[14]。張旻等通過對咬合壓力的有限元分析，得出咬合壓力約為300kPa，但其對細(xì)胞加力之后，發(fā)現(xiàn)90kPa的動(dòng)態(tài)壓力對細(xì)胞活性有明顯促進(jìn)作用，而150kPa對細(xì)胞活性略有抑制[11，15-16]。因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)間歇性壓力的加載要求，在張旻等對體外細(xì)胞周期性流體靜壓加力裝置研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了0～50kPa，0～90kPa和0～150kPa的力值分組，以在體外分別模擬牙周膜承受正常力和過大力狀態(tài)，研究健康和炎性hPDLCs在承受不同范圍力學(xué)刺激時(shí)炎癥狀態(tài)的差異。

新近研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激的直接和間接參與是導(dǎo)致牙周組織破壞的關(guān)鍵因素，牙周炎不僅是氧化應(yīng)激相關(guān)的全身疾病的局部表現(xiàn)，也可以通過氧化應(yīng)激來促進(jìn)這些疾病的進(jìn)展[17]。氧化應(yīng)激是由于ROS生成過多，破壞了與抗氧化機(jī)制間的平衡，從而導(dǎo)致潛在病理損傷的過程。牙周炎的始動(dòng)因素是細(xì)菌，而細(xì)菌對宿主的侵襲又導(dǎo)致了ROS的產(chǎn)生。研究表明線粒體和ROS有著密切的聯(lián)系，例如間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中，線粒體生物合成增加、氧化作用增強(qiáng)并伴隨著抗氧化能力的提高[18]。因此，本研究檢測了周期性動(dòng)態(tài)壓應(yīng)力對hPDLCs線粒體發(fā)育與功能的影響，發(fā)現(xiàn)過大力顯著降低了線粒體的發(fā)育水平及功能。本研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α、TFAM及NRF-1等線粒體發(fā)育標(biāo)志基因表達(dá)水平在較小及正常力范圍的動(dòng)態(tài)負(fù)載作用下的hPDLCs中并無顯著性改變，表明較小或正常力作用對牙周膜細(xì)胞中的線粒體發(fā)育功能并沒有顯著影響。但在過大力作用下，這三個(gè)線粒體發(fā)育標(biāo)志基因均出現(xiàn)明顯下調(diào)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明即使該力并未直接影響細(xì)胞的增殖活性，但對于其線粒體的發(fā)育功能已有顯著的抑制作用，表明細(xì)胞線粒體生物合成功能受到影響，并推測可能會進(jìn)一步影響細(xì)胞增殖、凋亡與自噬，但尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。而線粒體功能標(biāo)志基因Cox7a1調(diào)控組織中與氧化相關(guān)的酶的活性，反映組織或細(xì)胞的氧化還原水平。其在正常力作用下的hPDLCs中表達(dá)升高，但在過大力下被下調(diào)，說明適度的機(jī)械刺激有利于線粒體氧化還原功能的發(fā)揮，但過大力則會抑制其生理功能的釋放。而同樣作為細(xì)胞色素氧化酶的亞基的Cox8b是線粒體電子轉(zhuǎn)運(yùn)的末端氧化酶，其在不同力作用下的hPDLCs中表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這種差異性表達(dá)結(jié)果與之前研究的結(jié)果一致，分析這可能與其在線粒體氧化還原電子轉(zhuǎn)運(yùn)中的具體作用位點(diǎn)不同有關(guān)[19]。

本研究表明，過大的周期性咬合力影響了線粒體發(fā)生與抗氧化防御系統(tǒng)，從而對hPDLCs生物學(xué)功能造成損害。其進(jìn)一步機(jī)制有待后續(xù)研究闡明，以求為基于hPDLCs的牙周組織維護(hù)提供新的理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Rubin J，Rubin C，Jacobs CR.Molecular pathways mediating mechanical signaling in bone[J].Gene，2006，367：1-16.

[2]Klein-Nulend J，Bacabac RG，Bakker AD.Mechanical loading and how it affects bone cells： the role of the osteocyte cytoskeleton in maintaining our skeleton[J].Eur Cell Mater，2012，24：278-291.

[3]Mabuchi R，Matsuzaka K，Shimono M.Cell proliferation and cell death in periodontal ligaments during orthodontic tooth movement[J].J Periodontal Res，2002，37（2）：118-124.

[4]Muramoto T，Takano Y，Soma K.Time-related changes in periodontal mechanoreceptors in rat molars after the loss of occlusal stimuli[J].Arch Histol Cytol，2000，63（4）：369-380.

[5]Bullon P，Newman HN，Battino M.Obesity， diabetes mellitus， atherosclerosis and chronic periodontitis： a shared pathology via oxidative stress and mitochondrial dysfunction？[J].Periodontol 2000，? ? ?2014，64（1）：139-153.

[6]Kumar J，Teoh SL，Das S，et al.Oxidative stress in oral diseases： understanding its relation with other systemic diseases[J].Front Physiol，2017，8：693.

[7]Zhang H，Menzies KJ，Auwerx J.The role of mitochondria in stem cell fate and aging[J].Development，2018，145（8）. pii：dev143420.

[8]Garcia-Perez C，Roy SS，Naghdi S，et al.Bid-induced mitochondrial membrane permeabilization waves propagated by local reactive oxygen species （ROS） signaling[J].Proc Natl Acad Sci USA，2012，109（12）：4497-4502.

[9]Sinha K，Das J，Pal PB，et al.Oxidative stress： the mitochondria-dependent and mitochondria-independent pathways of apoptosis[J].Arch Toxicol，2013，87（7）：1157-1180.

[10]Xue P，Li B，An Y，et al.Decreased MORF leads to prolonged endoplasmic reticulum stress in periodontitis-associated chronic inflammation[J].Cell Death Differ，2016，23（11）：1862-1872.

[11]趙螢，陳慧，張旻.流體靜壓力對BMSCs/PRF復(fù)合構(gòu)建的組織工程軟骨移植物力學(xué)性能的影響[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2018，34（3）：249-253.

[12]Nyman S，Gottlow J，Karring T，et al.The regenerative potential of the periodontal ligament. An experimental study in the monkey[J].J Clin Periodontol，1982，9（3）：257-265.

[13]Li Y，Zheng W，J-S L，et al.Expression of osteoclastogenesis inducers in a tissue model of periodontal ligament under compression[J].J Dent Res，2011，90（1）：115-120.

[14]Wenger KH，El-Awady AR，Messer RL，et al.Pneumatic pressure bioreactor for cyclic hydrostatic stress application： mechanobiology effects on periodontal ligament cells[J].J Appl Physiol（1985），2011，? ? ?111（4）：1072-1079.

[15]Zhao YH，Lv X，Liu YL，et al.Hydrostatic pressure promotes the proliferation and osteogenic/chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells： The roles of RhoA and Rac1[J].Stem Cell Res，2015，14（3）：283-296.

[16]鄒德慧，趙瑩，趙寅華，等.周期性動(dòng)態(tài)壓力對人牙周膜干細(xì)胞中力生長因子表達(dá)的影響[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2016，26（4）：191-196.

[17]D'Aiuto F，Nibali L，Parkar M，et al.Oxidative stress， systemic inflammation， and severe periodontitis[J].J Dent Res，2010，89（11）：? ? ? 1241-1246.

[18]Chen CT，Shih YR，Kuo TK，et al.Coordinated changes of mitochondrial biogenesis and antioxidant enzymes during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J].Stem Cells，2008，26（4）：960-968.

[19]Liu J，Kong X，Wang L，et al.Essential roles of 11β-HSD1 in regulating brown adipocyte function[J].J Mol Endocrinol，2013，50（1）：103-113.

[收稿日期]2019-04-11

本文引用格式：賈如，衣穎杰，劉潔，等.不同大小動(dòng)態(tài)載荷對牙周膜細(xì)胞線粒體發(fā)育及功能的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（11）：86-89.