柳芳 趙宇 馬莉

[摘要]目的：探索改良型富血小板纖維蛋白（advance platetel-rich fribin，A-PRF）與普通型富血小板纖維蛋白（platetel-rich fribin，PRF）在脂肪移植中的應(yīng)用效果，進(jìn)而為臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。方法：將18只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分成三組，實(shí)驗(yàn)組（A-PRF組）：取兔背部脂肪組織，將2ml A-PRF+1ml顆粒脂肪移植到兔耳分離好的區(qū)域;陽(yáng)性對(duì)照組（PRF組）：兔耳移植區(qū)移入2ml PRF+1ml顆粒脂肪;陰性對(duì)照組（NS組）：兔耳移植區(qū)移入2ml生理鹽水+1ml顆粒脂肪。分別于4周、8周、12周取材進(jìn)行大體觀察、稱(chēng)重、HE染色與免疫染色來(lái)比較三組間脂肪成活差異。結(jié)果：各時(shí)間點(diǎn)，A-PRF組的脂肪存活率及新生毛細(xì)血管密度明顯優(yōu)于其他兩組，PRF組結(jié)果優(yōu)于NS組，且三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：A-PRF在增加脂肪細(xì)胞成活率、減輕炎癥反應(yīng)及促進(jìn)毛細(xì)血管新生方面優(yōu)于普通型PRF，這為A-PRF的臨床使用提供參考。

[關(guān)鍵詞]A-PRF;PRF;顆粒脂肪移植;脂肪細(xì)胞成活率;VEGF;細(xì)胞因子

[中圖分類(lèi)號(hào)]R622 ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A ? ?[文章編號(hào)]1008-6455（2019）11-0082-04

Abstract： Objective ?To explore the application of advanced platelet-rich fibrin （A-PRF） and common platelet-rich fibrin （PRF） in fat transplantation in rabbit. Provide guidance for clinical applications. Methods ?Eighteen experimental rabbits were divided into three groups randdomly. The experimental group（A-PRF group）： adipose tissue was taken， and 2ml A-PRF+1ml granule fat was transplanted into the isolated area of rabbit ears. The positive control group（PRF group）： 2ml PRF+1ml granule fat was transferred into the transplantation area. The negative control group（NS group）： 2ml physiological saline +1ml granular fat was transplanted. Gross observation， weighing， HE staining and immunostaining were performed at 4 weeks， 8 weeks， and 12 weeks to compare the survival of fat between the three groups. Results ?At each observation time， the fat survival rate and neonatal capillary density of the A-PRF group were significantly better than the other two groups. The positive control group was superior to the negative control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion ?A-PRF is superior to common PRF in increasing the survival rate of adipocytes， reducing inflammation and promoting capillary angiogenesis， which provides a reference for the use of A-PRF in clinic.

Key words： A-PRF; PRF; granular fat transplantation; adipocyte survival rate; VEGF; cytokines

自體顆粒脂肪移植是整形學(xué)科常規(guī)項(xiàng)目，常用于軟組織缺損修復(fù)，原因如下：①自身脂肪移植避免了移植后的免疫排斥，組織相容性好;②脂肪來(lái)源廣泛，供區(qū)提供脂肪的同時(shí)可局部塑形;③移植后的脂肪細(xì)胞可部分存活，有效地保持了受區(qū)的體積。然而脂肪移植后伴隨而來(lái)的壞死、液化、鈣化、囊腫形成等限制了其臨床應(yīng)用。臨床上通過(guò)各種方法來(lái)提升移植脂肪的存活率，如脂肪干細(xì)胞與基質(zhì)血管成分（stromal vascular fraction，SVF）聯(lián)合脂肪細(xì)胞移植、各種生長(zhǎng)因子及后來(lái)的富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）[1]與富血小板纖維蛋白（platetel-rich fribin，PRF）[2]、抗氧化劑添加、促進(jìn)血管生成藥物使用、獲取過(guò)程減少脂肪細(xì)胞的損傷、注射方法的改進(jìn)等。其中PRF是生長(zhǎng)因子輔助脂肪細(xì)胞移植思路的延續(xù)，PRF是血液離心時(shí)引發(fā)內(nèi)源性凝血途徑產(chǎn)生的富血小板纖維蛋白，其內(nèi)富含血小板、細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞[3-4]，PRF明顯提升脂肪存活率。改良型富血小板纖維蛋白（advance platetel-rich fribin，A-PRF）是低速長(zhǎng)時(shí)間離心得到的，已有基礎(chǔ)研究提示A-PRF在機(jī)械韌度[5]及細(xì)胞因子釋放各種方面的優(yōu)越性[6]。本實(shí)驗(yàn)觀察A-PRF、PRF在脂肪移植保存率方面是否有差別，為臨床工作提供思路。

1 ?材料和方法

1.1 研究對(duì)象：18只健康新西蘭大白兔，雌雄隨機(jī)，體重（3.7±0.2）kg，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房?jī)?nèi)，飼養(yǎng)條件符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求，實(shí)驗(yàn)征得實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器：實(shí)驗(yàn)臺(tái)，無(wú)菌實(shí)驗(yàn)包，骨膜剝離子，注射器，10%水合氯醛，剃毛機(jī)，離心機(jī)，冰箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PRF與A-PRF制備：麻醉前，采集兔耳中動(dòng)脈血10ml于無(wú)抗凝劑的干管內(nèi)，3 000r/min離心10min制備普通型PRF，2 000r/min離心24min制備A-PRF，均置于零下4℃冰箱內(nèi)冷藏30min備用。

1.3.2 脂肪獲取：麻醉后剃除兔頸背部兔毛，面積約7cm×5cm，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)。以兔耳中動(dòng)脈和耳緣靜脈交界處為a點(diǎn)，耳緣靜脈末端為b點(diǎn)，取ab中點(diǎn)為圓點(diǎn)，1.5cm為半徑畫(huà)圓，標(biāo)記雙耳待剝離區(qū)域。常規(guī)消毒鋪巾，取頸背部正中切口，分離出約5ml脂肪，去除筋膜，剪至1mm3均勻顆粒待用。

1.3.3 分組：將18只新西蘭兔隨機(jī)分成3組，陽(yáng)性對(duì)照組（PRF組）：1ml顆粒脂肪+2ml PRF凝膠;陰性對(duì)照組（NS組）：1ml顆粒脂肪+2ml生理鹽水;實(shí)驗(yàn)組（A-PRF組）：1ml顆粒脂肪+2ml A-PRF凝膠。

1.3.4 脂肪移植：小型骨膜剝離子沿標(biāo)記區(qū)域在皮膚與軟骨層間剝離，鑷子取出干管內(nèi)PRF與A-PRF凝膠，小心減去下方的紅色血凝塊，注意保留富血小板纖維蛋白凝膠連接處的紅細(xì)胞層。在未去除凝膠內(nèi)水分的情況下（有研究表明細(xì)胞因子主要來(lái)自于纖維蛋白滲出產(chǎn)物[7]），剪至1mm3均勻顆粒，按照分組將富血小板纖維蛋白與脂肪均勻混合，移植到兔耳剝離區(qū)域內(nèi)，縫合線結(jié)扎關(guān)閉切口（見(jiàn)圖1～3），術(shù)后每只實(shí)驗(yàn)兔以慶大霉素80萬(wàn)單位連續(xù)肌注3d。

1.4 觀察指標(biāo)：①大體觀察;②標(biāo)本重量;③HE染色觀察脂肪細(xì)胞成活情況;④免疫組化觀察脂肪內(nèi)新生毛細(xì)血管密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，檢驗(yàn)方差齊性后，多組均數(shù)間的兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 大體觀察：根據(jù)大體觀察及稱(chēng)重結(jié)果可見(jiàn)：第4周可見(jiàn)A-PRF組重量大于PRF組，NS組脂肪最小;第8周時(shí)三組脂肪重量均較第4周有明顯增加，A-PRF組脂肪重量增長(zhǎng)最大;12周時(shí)脂肪重量較8周有所回落，但仍舊稍高于4周，A-PRF組回落最緩。見(jiàn)表1，圖4～5。

2.2 組織學(xué)觀察：4周同樣顯微倍數(shù)下一個(gè)視野內(nèi)A-PRF組脂肪細(xì)胞較其他兩組多，且A-PRF組脂肪從大小及排列分布更均勻，相比于其他兩組有更多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。同樣，PRF組脂肪切片染色優(yōu)于NS組。8～12周時(shí)A-PRF組與PRF組間上述差距減少，但A-PRF組仍舊有較高密度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)在脂肪細(xì)胞周?chē)?，NS組脂肪細(xì)胞大小分布不均，且脂肪細(xì)胞數(shù)量少，三組間有明顯的纖維生成。見(jiàn)圖6。

2.3 免疫組化結(jié)果：4周時(shí)A-PRF組脂肪間免疫染色明顯多于PRF組，A-PRF組可見(jiàn)明顯新生血管形成;8～12周時(shí)兩者間未見(jiàn)明顯區(qū)別，但加入A-PRF組的脂肪細(xì)胞形態(tài)明顯好于另外兩組。見(jiàn)圖7。

3 ?討論

PRF是血液在離心力作用下促發(fā)內(nèi)源性凝血機(jī)制得到的類(lèi)似于天然纖維蛋白的凝膠狀物質(zhì)，相較于由加入抗凝劑制備而來(lái)的PRP相比較，PRF制作工藝簡(jiǎn)單，且無(wú)需考慮抗凝劑的安全性。PRF具有強(qiáng)大的促增殖能力，尤其是在骨誘導(dǎo)方面，由口腔科引入的PRF在促進(jìn)脂肪成活方面不如骨誘導(dǎo)效果顯著。A-PRF是2013年新提出的概念，是由更低轉(zhuǎn)速更長(zhǎng)時(shí)間離心出的血制品。A-PRF結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞及相應(yīng)因子分布不同于普通性PRF，中性粒細(xì)胞在A-PRF中分布廣泛。已有相應(yīng)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究PRF與A-PRF兩者間的生物特性上的區(qū)別，但有關(guān)兩者的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面的應(yīng)用很少，本實(shí)驗(yàn)主要研究?jī)烧邔?duì)于脂肪移植中細(xì)胞成活率的區(qū)別。

3.1 脂肪移植：正常脂肪可耐受缺氧極限為24h，而脂肪來(lái)源的干細(xì)胞耐缺氧的時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)72h，脂肪干細(xì)胞在脂肪移植后的組織重塑中起關(guān)鍵作用[8]。移植后的脂肪細(xì)胞除移植區(qū)域周邊的細(xì)胞可通過(guò)局部滲透來(lái)獲取營(yíng)養(yǎng)存活，移植中間區(qū)域的細(xì)胞則需要新生的毛細(xì)血管生成提供營(yíng)養(yǎng)，而正常新生血管形成需約1周時(shí)間。關(guān)于脂肪移植后體積的減少有關(guān)專(zhuān)家認(rèn)為與移植中脂肪細(xì)胞的受損、炎癥聚集導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡與死亡和移植后脂肪細(xì)胞去分化的非壞死性死亡有關(guān)[9]。移植區(qū)域的體積維持原因包括宿主取代與細(xì)胞存活兩種因素，宿主取代理論認(rèn)為移植后脂肪細(xì)胞壞死繼而引起宿主巨噬細(xì)胞的吞噬，吞噬了脂滴的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成成熟脂肪細(xì)胞;細(xì)胞存活理論則認(rèn)為移植后脂肪細(xì)胞或干細(xì)胞的存活維持了移植后的受區(qū)體積[9]。脂肪細(xì)胞在移植后去分化形成不含脂滴的成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞稱(chēng)為去分化脂肪細(xì)胞，去分化脂肪細(xì)胞可更好的耐受缺氧，后可再分化為脂肪細(xì)胞[9]。無(wú)論是有關(guān)脂肪去分化的重塑還是脂肪干細(xì)胞的成活都在脂肪移植中占有重要地位。

3.2 PRF：PRF首先應(yīng)用于口腔科，其在骨組織再生方面應(yīng)用廣泛[10]。PRF結(jié)構(gòu)接近天然纖維蛋白，包含有細(xì)胞因子、血小板、纖維蛋白相關(guān)聚糖鏈、循環(huán)糖蛋白和纖維蛋白原。PRF中存在雙側(cè)連接和等邊連接，使其具有剛性結(jié)構(gòu)和可移動(dòng)性，為脂肪細(xì)胞增殖遷移做指引。PRF凝塊可緩慢釋放出IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子和IL-4等抗炎因子，還包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），其是已知最強(qiáng)大促進(jìn)血管生長(zhǎng)因子[11]。這些細(xì)胞因子可有效地減少移植后脂肪存活區(qū)域內(nèi)的炎癥反應(yīng)，同時(shí)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向移植區(qū)域遷移，穩(wěn)定區(qū)域內(nèi)環(huán)境，VEGF可有效地促進(jìn)中心區(qū)的新生毛細(xì)血管生長(zhǎng)，為缺氧的脂肪細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)。相較于釋放時(shí)間短暫的PRP，PRF釋放時(shí)間從5～10min開(kāi)始，持續(xù)60～300min，保證了移植區(qū)內(nèi)長(zhǎng)久有效的細(xì)胞因子濃度。血液離心后得到產(chǎn)物HE染色由上至下：HE染色：淡黃色清亮的貧細(xì)胞層、黃色的凝膠層、紅細(xì)胞層。PRF凝膠層電鏡下結(jié)構(gòu)為上部的纖維蛋白，中間的白細(xì)胞與下部的紅細(xì)胞層[11-12]。而A-PRF在電鏡觀察下發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)上更疏松且纖維蛋白結(jié)構(gòu)空間更大，細(xì)胞因子分布更加均勻，包含更高濃度的中性粒細(xì)胞。而PRF的促進(jìn)軟硬組織生長(zhǎng)機(jī)制似乎正與這種纖維蛋白結(jié)構(gòu)相關(guān)，同樣條件培養(yǎng)PRF與A-PRF使其緩慢釋放細(xì)胞因子[3]，ELISA分析發(fā)現(xiàn)A-PRF無(wú)論是釋放時(shí)間抑或是釋放高峰濃度上都占明顯優(yōu)勢(shì)[6]。

A-PRF在輔助兔脂肪細(xì)胞移植方面優(yōu)于PRF，可進(jìn)一步在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床上觀察兩者輔助脂肪細(xì)胞移植修復(fù)軟組織缺損方面的區(qū)別。本實(shí)驗(yàn)仍有需要改進(jìn)的方面：①不同年齡與性別的新西蘭實(shí)驗(yàn)兔止凝血功能不同，血小板數(shù)量功能不同，導(dǎo)致采取的離心血液中細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞纖維蛋白量不同;②PRF凝膠離心后體積較難控制完全一致，具有實(shí)驗(yàn)誤差;③不同觀察時(shí)間的移植物中中性粒細(xì)胞指標(biāo)未觀察。

綜上所述，富血小板纖維蛋白可促進(jìn)實(shí)驗(yàn)兔移植脂肪的存活率，且A-PRF促進(jìn)脂肪細(xì)胞成活作用更明顯，推測(cè)其可能與A-PRF三維空間結(jié)構(gòu)、細(xì)胞因子濃度及中性粒細(xì)胞比例有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)有一定的臨床指導(dǎo)意義，有關(guān)于A-PRF與顆粒脂肪的比例以及是否A-PRF在脂肪加工產(chǎn)物如納米脂肪應(yīng)用效果如何，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和探討。

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[收稿日期]2019-04-29

本文引用格式：柳芳，趙宇，馬莉，等.改良型PRF與普通型PRF在脂肪移植應(yīng)用中的實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2019，28（11）：82-85.