韓志強 殷國前 嚴業(yè)勇

[摘要]目的：觀察應用前列地爾注射液對兔耳靜脈瘀血皮瓣微循環(huán)的影響。方法：選取健康普通大耳白兔16只，隨機分成生理鹽水對照組及前列地爾注射液治療組，每組8只。麻醉后于左耳背制作大小6cm×3cm的靜脈瘀血皮瓣模型。皮瓣成形術后立刻于對照組右耳緣靜脈緩慢注入生理鹽水2ml，治療組緩慢注入前列地爾注射2ml（1μg/1ml），每天同一時間點注射一次至實驗結束，觀察皮瓣外觀及皮瓣存活率，分別于術后1、3、5、7d，各組分別隨機取1只，切取皮瓣中點處皮瓣組織，HE染色觀察紅細胞瘀積及炎癥細胞浸潤等情況，免疫組織化學染色觀察皮瓣中VEGF及HIF-1α的表達情況。結果：治療組皮瓣腫脹情況、瘀血情況均明顯較對照組輕。治療組皮瓣成活率為（90.80±3.27）%明顯高于對照組的（67.20±2.59）%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。HE染色結果示治療組紅細胞瘀積及炎癥細胞浸潤等情況明顯較對照組輕;免疫組織化學結果示治療組皮瓣中VEGF的陽性表達量明顯高于對照組，HIF-1α的陽性表達量明顯低于對照組。結論：前列地爾注射液通過促進皮瓣組織中VEGF的表達和降低皮瓣中HIF-1α的表達量，促進瘀血皮瓣中新生血管的生成速度及減輕瘀血皮瓣的缺血缺氧雙重作用改善瘀血皮瓣的微循環(huán)，提高靜脈瘀血皮瓣的存活面積。?

[關鍵詞]靜脈瘀血;前列地爾注射液;微循環(huán);皮瓣;兔耳模型

[中圖分類號]R622 ? ?[文獻標志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2019）11-0077-05

Abstract： Objective ?To observe the effect of alprostadil injection on microcirculation of rabbit auricular venous congestion skin flaps. Methods ?Sixteen healthy rabbits were randomly divided into two groups： the control group（injecting saline group） and the treatment group （alprostadil injection group）， each of 8. After anesthesia， the model of venous congestion skin flap was made on the back of the left ear with the size of 6cm×3cm. The treatment group was injected with alprostadil 2ml（1μg/1ml）， and the control group saline（2ml/flap） through the marginal vein of right ear slowly ?after the flap plasty， which were injected at the same time every day until the end of the experiment， the appearance of the flaps and the survival rate of the flaps were observed. On the 1d， 3d， 5d and 7d after operation， one of the flaps was randomly selected from each group. The tissue of the flaps at the midpoint of the flaps was cut. After section， HE staining was used to observe erythrocyte deposition and inflammatory cell infiltration. Immunohistochemical staining was used to observe the expression of vascular endothelial growth factor and HIF-1α in the flaps. Results ?All of the flaps were swollen and congested after operation， the swelling and congestion of the flaps in the treatment group were significantly lighter than those in the control group. The survival rate of flaps in the treatment group was （90.80±3.27）%， which was significantly higher than that in the control group（67.20±2.59）%， the difference was statistically significant（P<0.05）. HE staining showed that erythrocyte deposition and inflammatory cell infiltration in the treatment group were significantly lighter than those in the control group. Immunohistochemical results showed that the positive expression of vascular endothelial growth factor in skin flaps of the treatment group was significantly higher than that of the control group， and the positive expression of HIF-1α was significantly lower than that of the control group. Conclusion ?Alprostadil injection can improve the survival area of venous congestion flaps by promoting the expression of vascular endothelial growth factor in skin flaps and reducing the expression of HIF-1α in skin flaps， promoting the rate of neovascularization in congested skin flaps and alleviating the hypoxia and ischemia of congested skin flaps.

Key words： venous congestion; alprostadil injection; microcirculation; skin flap; rabbit ear model

皮瓣或肌皮瓣移植是整形外科或創(chuàng)傷外科修復組織缺損最常見也是最基本的治療方法，被廣泛運用于瘢痕攣縮松解、皮膚腫瘤、創(chuàng)傷性皮膚軟組織缺損、糖尿病性潰瘍、褥瘡等組織缺損的修復重建[1-3]。但皮瓣移植術后靜脈瘀血是常見的并發(fā)癥，嚴重者可發(fā)展成為靜脈危象，影響皮瓣成活，最終可能導致治療失敗。因此如何減輕皮瓣術后靜脈瘀血，改善皮瓣微循環(huán)，減少皮瓣缺血缺氧壞死，提高皮瓣成活質(zhì)量，擴大皮瓣成活面積成為整形或創(chuàng)傷外科醫(yī)生關注的焦點之一。前列地爾注射液具有抗血小板聚集、抑制血栓形成、擴張血管、改善微循環(huán)、保護細胞、防止組織損傷等眾多生理學和藥理學作用特點[4-8]，通過其改善心肌的缺血缺氧廣泛應用于心血管疾病的治療[9]，如治療缺血性心臟病[10-11];外周動脈閉塞性疾病的治療[12];防止腎血管血栓形成、改善腎臟缺血缺氧，預防造影劑腎?。–IN）的發(fā)生[13-15]，改善糖尿病腎病的腎功能[16]，且效果肯定，但應用于改善靜脈瘀血皮瓣的微循環(huán)報道甚少。本實驗通過建立兔耳靜脈瘀血皮瓣模型，探討前列地爾注射液對靜脈瘀血皮瓣微循環(huán)的影響，觀察前列地爾注射液對靜脈瘀血皮瓣成活的保護作用。

1 ?材料和方法

1.1 主要實驗試劑及儀器：前列地爾注射液（北京泰德制藥股份有限公司），兔抗人VEGF IgG單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）、兔抗人HIF-1α單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）、通用型二步法免疫組化檢測試劑（PV-9000）（北京中杉金橋生物公司）、抗原修復液（Ethylenediamine tetra.acetic acid，EDTA）（北京中杉金橋生物公司）、PBS緩沖液（北京中杉金橋生物公司）、濃縮型DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物公司）、封閉用山羊血清工作液（北京中杉金橋生物公司）、Olympus-B X50 顯微鏡（Olympus 公司，日本）。

1.2 實驗動物及分組：健康普通大耳白兔16只，雌雄不限，體質(zhì)量（2.5±0.5）kg（廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供），隨機分為生理鹽水對照組、前列地爾注射液治療組，每組8只。

1.3 實驗設計：術前用氯胺酮及鹽酸塞拉嗪等比例混合后按0.2ml/kg體重肌肉內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，將實驗兔固定于兔臺上，于兔左耳背部設計以耳后動脈為蒂大小為6cm×3cm的軸型皮瓣（蒂寬1cm，見圖1）。術區(qū)碘伏消毒后鋪無菌巾，沿設計線全層切開皮瓣，達軟骨膜表面，從皮瓣遠端向近端于軟骨膜表面剝離，皮瓣徹底止血。借用光學顯微鏡，仔細分離皮瓣蒂部的耳后動、靜脈及伴隨神經(jīng)后結扎離斷靜脈及神經(jīng)，僅保留耳后動脈，制成以耳中央動脈為唯一血供，1cm寬的蒂部為唯一靜脈回流途徑的經(jīng)典靜脈瘀血皮瓣模型。檢查創(chuàng)面無明顯出血用 3-0絲線間斷原位縫合（見圖1）。皮瓣成形術后立刻于對照組右耳緣靜脈緩慢注入生理鹽水2ml，治療組緩慢注入前列地爾注射2ml（1μg/1ml），每天同一時間點注射一次至實驗結束。定期觀察皮瓣變化。實驗動物均由專人飼養(yǎng)，飼養(yǎng)場地、飼料及人員由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供。實驗所用器械及材料均經(jīng)過嚴格消毒且整個過程均在無菌條件下進行。為減少手術操作帶來的誤差，所有手術均由1人完成。

1.4 觀察指標

1.4.1 大體觀察：術后定期觀察并記錄實驗兔的精神狀態(tài)及飲食情況，觀察皮瓣的顏色變化、腫脹程度、有無感染及壞死變化情況，并做相應記錄、拍照。

1.4.2 皮瓣成活面積：術后7d測量瘀血皮瓣成活面積，觀察各組間皮瓣存活情況。用標準網(wǎng)格試紙測量皮瓣成活面積、總面積。將皮瓣總面積減去成活區(qū)面積即可得到壞死區(qū)域的面積。計算皮瓣存活率。成活率=皮瓣存活面積/皮瓣總表面積×100%。

1.4.3 HE染色組織學觀察：術后1、3、5、7d，各組分別隨機取1只于皮瓣中點處切取5mm×5mm全層皮膚組織，10%甲醛固定后石蠟包埋，切取片厚4μm，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，觀察紅細胞瘀積及炎癥細胞浸潤等情況。

1.4.4 免疫組織化學染色觀察：采用免疫組織化學染色檢測皮瓣成形術后1、3、5、7d切片組織中VEGF的表達情況，以真皮下毛細血管內(nèi)皮細胞胞漿中有棕黃色顆粒為陽性細胞標準。免疫組織化學Envision二步法檢測術后1，3、5、7d切片組織中缺氧誘導因子1α（HIF-1α）的表達情況，HIF-lα以細胞質(zhì)呈棕黃色或黃色為陽性，有時亦見于包膜，細胞核偶見染色。

1.5 統(tǒng)計學分析：所有實驗數(shù)據(jù)結果以均數(shù)±標準差（x?±s）表示，采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 ?結果

2.1 大體觀察：實驗兔麻醉蘇醒后，精神狀態(tài)較差，偶爾自行飲水，未見進食;術后1d，進食、飲水、精神狀態(tài)基本恢復至術前狀態(tài)。術中觀察發(fā)現(xiàn)，皮瓣成形術后所有皮瓣創(chuàng)緣均有滲血，明顯腫脹，皮瓣遠端顏色暗紅，瘀血形成;術后第1天觀察發(fā)現(xiàn)對照組皮瓣顏色明顯深于治療組，邊緣仍有少許滲血;術后3d治療組皮瓣腫脹情況、瘀血情況均明顯較對照組輕，治療組遠端瘀血范圍較前縮窄，且邊界漸清晰;術后7d皮瓣腫脹消退，壞死區(qū)域邊界較清楚，對照組皮瓣壞死范圍明顯大于治療組（見圖2）。所有皮瓣均無傷口感染、膿腫形成、血腫形成、傷口裂開等情況。

2.2 皮瓣成活情況：治療組皮瓣存活率為（90.80±3.27）% [（16.32±0.58）cm2/18cm2]明顯高于對照組的（67.20±2.59）% [（12.08±0.46）cm2/18cm2]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.3 HE染色組織學觀察：對照組：皮瓣術后第l、3天，真皮內(nèi)毛細血管及微靜脈內(nèi)可見大量紅細胞聚集，單核及中性粒細胞附壁，可見皮下微靜脈內(nèi)血栓;術后第5天可見紅細胞聚集變性含鐵血黃素釋放染成淡黃色，紅細胞聚集逐漸消散。術后7d毛細血管及微靜脈內(nèi)紅細胞聚集程度有所減輕，無紅細胞瘀積現(xiàn)象，皮膚層次清晰，其中可見少量新生血管。治療組：術后第1、3天可見部分擴張的管腔內(nèi)少量紅細胞聚集，未見血栓形成;術后第5、7天毛細血管及微靜脈內(nèi)紅細胞聚集消散，血管增生較為明顯，分布較密集，管腔較小。見圖3。

2.4 免疫組織化學染色觀察VEGF和HIF-1α的變化情況

2.4.1 VEGF表達情況：VEGF的表達以真皮下毛細血管內(nèi)皮細胞胞漿中有棕黃色顆粒為陽性細胞標準，同一時間點治療組的VEGF陽性表達率明顯高于對照組。見圖4。

2.4.2 HIF-lα蛋白表達情況：HIF-lα蛋白主要定位在血管內(nèi)皮細胞以及成纖維細胞內(nèi)，表現(xiàn)為棕黃色顆粒分布于胞漿內(nèi)，顏色從淺黃色到深棕色。同一時間點治療組皮瓣中HIF-1α陽性表達率明顯低于對照組，即同一時間點對照組缺血缺氧程度比治療組嚴重。見圖5。

3 ?討論

皮瓣移植術是整形或創(chuàng)傷外科修復創(chuàng)面及組織缺損最常用也是最基本的方法，但皮瓣移植后常出現(xiàn)靜脈瘀血等并發(fā)癥，表現(xiàn)為血液瘀積于小靜脈和毛細血管內(nèi)，皮瓣外觀腫脹、呈紫色的臨床現(xiàn)象[17]。如果皮瓣靜脈瘀血沒有被及時糾正，最初會導致皮瓣組織的組織間隙壓力持續(xù)增高，繼發(fā)毛細血管血流變慢，紅細胞積聚、血小板及纖維蛋白原沉積和血液成分的溢出，進一步發(fā)展為靜脈危象，隨后形成的微血栓就會導致皮瓣供血不足導致皮瓣部分或全部壞死，根據(jù)皮瓣壞死的面積情況，通常需要長時間換藥，再次手術清創(chuàng)、植皮或者轉移局部皮瓣來修復創(chuàng)面，給患者造成巨大的身心損害及經(jīng)濟負擔。因此如何解決皮瓣術后靜脈瘀血影響皮瓣成活率這一棘手問題成為整形或創(chuàng)傷外科醫(yī)生研究的熱點。在臨床治療中曾采取水蛭療法[18]、小切口引流、抗凝溶栓藥物[19]、高壓氧[20]、血管擴張劑、負壓吸引[21-22]以及最新的細胞和基因治療[23]等?？v然有這么多種方法供臨床選擇，但也都存在著各自的局限性，仍不可避免的會在臨床上遇到因靜脈瘀血而引起的皮瓣部分甚至完全壞死的情況。

前列地爾注射液以脂微球為藥物載體的靜脈用注射用前列地爾制劑，其主要成分是前列腺素E1（PGE1），具有抗血小板聚集、抗血栓形成、舒張血管平滑肌、保護細胞、改善微循環(huán)等諸多生物學功能[9，24]，其由于脂微球的包裹，使前列地爾不易失活，還具有易于分布到受損血管部位的靶向特性，比傳統(tǒng)制劑具有更好的被動靶向性、持續(xù)性、高效等用藥安全性等特點，從而更好地發(fā)揮擴張血管、抑制血小板凝集、抗血栓形成的作用[25]，相關研究還發(fā)現(xiàn)，前列地爾注射液能促進血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達[26-27]，而VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細胞的生長因子，能促進血管增生、轉移和分化新的血管，從而提高皮瓣的成活面積[28-29]。依據(jù)靜脈瘀血皮瓣的微循環(huán)障礙、有血栓形成等病理表現(xiàn)，通過抗血栓形成改善皮瓣缺血缺氧的同時促進新生血管生成是有效改善皮瓣瘀血的方法。

本實驗通過應用Miyawaki等[30]在2002年提出的運用兔耳建立靜脈瘀血皮瓣的模型，研究前列地爾注射液對于改善靜脈瘀血的作用。Miyawaki最終選擇蒂部寬度為lcm的兔耳皮瓣模型進行后期的實驗研究，每只實驗兔均采用左側兔耳（右側兔耳用于藥物注射），由于Miyawaki制作的靜脈瘀血皮瓣模型簡單、重復性好，術中切斷了耳部神經(jīng)以減少術后疼痛對皮瓣成活的影響，曾多位研究者采用此瘀血模型進行瘀血皮瓣的研究[31-32]。本實驗結果顯示局部注射前列地爾注射液能明顯加快兔耳皮瓣消腫及瘀血的消散速度，減輕瘀血皮瓣中紅細胞瘀積及炎癥細胞浸潤，提高皮瓣成活率。通過檢測同一時間段皮瓣中VEGF蛋白的表達情況發(fā)現(xiàn)，治療組皮瓣中VEGF的陽性表達量明顯高于對照組，這與Tang J[26]、Inoue H等[27]的研究結果是一致的。表明前列地爾注射液可以通過增加皮瓣中VEGF的表達量，加快瘀血皮瓣中新生血管的生成速度，使皮瓣與創(chuàng)基緣之間早期建立血運關系，從而促進瘀血皮瓣的成活率。

本實驗通過檢測皮瓣中HIF-1α蛋白的表達情況還發(fā)現(xiàn)，同一時間點治療組皮瓣中HIF-1α的表達量明顯低于對照組，缺氧誘導子-1α（HIF-1α）是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的一種轉錄因子，其表達最主要的調(diào)控因素是氧濃度，在常氧狀態(tài)下，各組織HIF-lα表達甚少，在低氧下情況下HIF-lα表達增加，其表達量的變化可方便、客觀、及時的反映瘀血皮瓣組織的缺血缺氧程度[33-34]。從本實驗結果可以說明治療組皮瓣缺血缺氧程度明顯較對照組輕，這與Haider DG等[35]的結果是一致的。皮瓣轉移后，前列地爾注射液通過其易于分布到受損血管部位特有的靶向特性，分布在皮瓣切緣及周圍發(fā)揮其擴張血管、抑制血小板凝集、抗血栓形成的作用，減少皮瓣內(nèi)血液瘀積，防止微循環(huán)繼續(xù)惡化，及時改善了皮瓣組織細胞缺血、缺氧，避免了大量微血栓的形成，繼而提高瘀血皮瓣的成活面積。組織學觀察結果也證實了治療組皮瓣紅細胞聚集及血栓形成情況較對照組輕，為前列地爾注射液治療皮瓣瘀血提供了理論支持。

綜上所述，本試驗初步證實前列地爾注射液通過增加皮瓣組織中VEGF的表達和降低皮瓣中HIF-1α的表達量，促進瘀血皮瓣中新生血管的生成速度及減輕瘀血皮瓣的缺血缺氧雙重作用以達到改善瘀血皮瓣的微循環(huán)，提高靜脈瘀血皮瓣的存活率。因此筆者認為靜脈注射前列地爾注射液是一種改善瘀血皮瓣微循環(huán)的有效方法，但對于其最佳劑注射劑量及注射時間點有待進一步研究探討。

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[收稿日期]2019-03-27

本文引用格式：韓志強，殷國前，嚴業(yè)勇.前列地爾注射液改善兔耳靜脈瘀血皮瓣微循環(huán)的研究[J].中國美容醫(yī)學，2019，28（11）：77-82.