唐偉健，付蕓

（長春理工大學 光電工程學院，長春 130022）

隨著觀測技術的不斷發(fā)展，單細胞水平的研究逐漸成為新的熱點。細胞生物學通過觀察細胞的形態(tài)結構、細胞器的運動和相互作用過程，揭示細胞生命活動的基本規(guī)律。因此，當研究一個生物系統(tǒng)時，可以通過觀察單個細胞的生長與分化等生命過程，深入了解生物機體的結構。如果能夠在分子水平上觀察生物現(xiàn)象，將有助于更好地理解細胞表型細微的差異是如何誘導生物現(xiàn)象的，如學習和記憶，或細胞的特異性變化是如何導致功能障礙和誘發(fā)疾病的，例如癌癥［1］。因此，對于細胞觀測方法的研究，包括實現(xiàn)其三維可視化建?？梢詭椭斫獍┌Y的形成機理，對分子動力學、生物仿生學、藥物發(fā)現(xiàn)和遺傳學的研究也具有重要意義。

本文采用共聚焦顯微鏡對已注入熒光探針的腫瘤細胞進行掃描，獲取一系列軸向二維斷層圖像。激光共聚焦顯微鏡（CLSM）利用激光束經照明針孔后形成的點光源逐點掃描焦平面上的樣本，樣本上的被照射點經探測針孔后，成像在光電倍增管（PMT）或冷電耦器件（cCCD）上，并通過計算機屏幕輸出熒光圖像。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面呈共軛關系，也就是說焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和探測針孔處，而焦平面以外的點則無法通過探測針孔成像在探測器上，經過逐點掃描就得到樣本上一個斷層圖像，再通過沿著軸向移動焦平面獲得一組二維熒光斷層圖像。本文將數(shù)字圖像處理技術，包括圖像去噪、圖像分割，以及三維重建等應用到細胞的熒光圖像處理中，實現(xiàn)二維斷層圖像的三維可視化建模，從而更加直觀地觀測細胞的內部結構。

1 圖像預處理

在共聚焦顯微光學成像過程中，由于成像系統(tǒng)本身、光子轉換過程、熒光組織結構和人為誤差等因素的影響，采集的圖像中必然包含噪聲，特別是當利用強激發(fā)光進行厚組織斷層成像時尤為明顯，所以必須對圖像進行預處理。

圖像預處理是指在圖像分割之前對細胞的熒光圖像進行降噪與增強的過程。通過預處理可以提高二維熒光斷層圖像的質量，增強細胞膜和細胞器的局部與整體結構特征，改善細胞三維可視化的效果。本文采用數(shù)學形態(tài)學的降噪方法進行細胞熒光圖像的預處理。

1.1 激光共聚焦顯微鏡圖像采集

激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯FV-1000）最大分辨率4 096×4 096，每個通道4 096個灰度級（12-bit），配有 405 nm、458 nm、488 nm、515 nm、559 nm、623 nm的激光器，本實驗選用405 nm氬離子和623 nm紅色氦氖激光器，分別用于激發(fā)細胞核和細胞膜探針，讀取細胞二維斷層圖像，通過沿Z軸移動焦點得到細胞的一系列二維斷層圖像。圖1為共聚焦采集的一組二維斷層圖像。

圖1 肝癌細胞熒光二維斷層28層部分圖像

1.2 數(shù)學形態(tài)學去噪算法

作為計算機數(shù)字圖像處理技術的一個研究方向，數(shù)學形態(tài)學是基于集合理論和晶格理論的組合圖像處理方法，用具有一定形態(tài)的結構元去度量和提取圖像中的對應形狀，以達到圖像分析和識別的目的。形態(tài)學在處理復合運算時具有顯著的優(yōu)勢，因而常用于圖像處理中［2］。其優(yōu)勢在于采用并行處理算法，既能保留圖像中原有信息又能有效地濾除噪聲，與基于微分運算的邊緣提取算法相比，基于數(shù)學形態(tài)學提取的邊緣信息平滑、圖像骨架連續(xù)，且斷點少。

數(shù)學形態(tài)學包括腐蝕和膨脹兩個基本運算。腐蝕用結構元與目標圖像進行邏輯運算，可以消除二值圖像中不相關的細節(jié)。腐蝕使圖像的邊界收縮，導致目標區(qū)域范圍縮小，而區(qū)域內的孔洞變大。運算公式可表示為：

膨脹會擴大前景圖像的邊界，使得圖像區(qū)域擴大，而區(qū)域內的孔洞變小。運算的表達式為：

腐蝕與膨脹具有不同的處理目的。腐蝕運算可以消除圖像中無意義的小物體。膨脹運算主要是為了彌補目標圖像中的小空洞，因而具有去除內部噪聲的作用。這兩種算法通過結合形成開運算和閉運算。開運算是先腐蝕再膨脹，主要功能是對內邊界點進行平滑處理，并保持圖像邊緣形狀和位置不發(fā)生變化，其表達式為：

閉運算是膨脹之后再進行腐蝕，主要目的是對目標圖像的細小空洞、外部邊緣毛刺及小橋噪聲點進行彌補，可表示為：

開運算和閉運算的用途不同。開運算處理外部細節(jié)對圖像所產生的影響，而閉運算處理內部細節(jié)對圖像的影響［3］。腐蝕運算可以消除一些小的空洞，膨脹運算通過邊緣擴展來消除邊緣毛刺。通過對細胞圖像的研究和對形態(tài)學四種運算的不同組合進行濾波，發(fā)現(xiàn)通過對閉運算、膨脹組合運算和腐蝕、開運算組合進行串聯(lián)組合運行能夠得到較好的去噪結果，線性組合得到組合濾波器的表達式如下［4］：

下圖為采用形態(tài)學算法的不同組合模式進行圖像去噪的效果對比。

圖2 形態(tài)學組合濾波器的處理效果對比圖

從圖2中看出，使用開運算和腐蝕結合形成的濾波器，不僅可以抑制毛刺和小橋噪聲點，而且能夠保護細胞邊緣信息。通過閉運算和膨脹的組合運算能夠抑制小孔噪聲和小縫噪聲，獲得平滑的細胞外邊緣信息［5］。還對細胞內部的小空洞進行彌補保持了完整且平滑的邊緣信息，基本消除圖像的噪聲。

2 圖像分割

在共聚焦顯微鏡采集的二維斷層圖像中，會同時出現(xiàn)多個細胞，甚至部分細胞黏連、重疊等復雜現(xiàn)象。因此，必須對目標圖像進行圖像分割以獲取單個細胞，這是細胞三維重建的前提。由于細胞的邊緣不規(guī)則而且具有非線性特征，如果采用線性分割算法會損失一部分邊界輪廓，而且會使重構算法更加復雜。本文運用數(shù)學形態(tài)學中的分水嶺算法進行圖像分割。

分水嶺算法是基于拓撲原理演變而成的圖像分割算法，拓撲表面上的高密度區(qū)域代表波峰，低密度代表波谷。用不同顏色的水（標志物）分別充滿各個波谷（即局部最低點），隨著水面升高，來自不同波谷、具有不同顏色的水匯合到一起。這時在水匯合的地方修建水壩，以防止水的融合。持續(xù)注水與修建水壩，直至所有的波峰都處于水面之下。這些水壩就是圖像分割的結果。這種方法已經用于血液和骨髓標本的圖像處理中［6］。

令 M1,M2,…,MR表示圖像g(x,y)的區(qū)域最小值點的坐標集合，C(Mi)表示與區(qū)域最小值Mi相關聯(lián)的分水嶺中的點坐標的集合，min和max分別表示g(x,y)的最小值和最大值。令T[n]表示滿足g(s , t)＜n的坐標集合，即：

T[n]是g(x,y)中位于平面g(x,y)=n下方的點坐標的集合。

令Cn(Mi)表示集水盆地中與淹沒階段n的最小值Mi相關聯(lián)的點坐標集，則Cn(Mi)可看成下式的二值圖像：

由公式（7）和（8）可知，C[n]是T[n]的子集，所以C[n -1]也為T[n]的子集，則C[n -1]中的每個連通分量都是T[n]的一個連通分量。

但是，由于細胞圖像中的特殊性，圖像邊緣會存在很多的局部極值點，影響分水嶺算法出現(xiàn)過度分割現(xiàn)象。首先，需要去除影響分割效果的區(qū)域極值點，然后將去除后的極值點的像素點在二值圖像中用“1”表示。通過對圖像中的前景和背景部分進行標記，分別為內部標記和外部標記。并且使內部標記指向背景，外部標記指向前景，通過標記的最小值可以確保分割線可以在內部標記和外部標記之間的區(qū)域，從而確保圖像分割的合理性和精準性，降低了過度分割程度保持圖像邊緣完整并取得較好的效果。圖3為分水嶺算法分離出的細胞膜及細胞核。

圖3 分水嶺分割細胞核和細胞膜圖像

3 三維重建

在細胞形態(tài)學研究中，主要使用共聚焦顯微鏡來觀察細胞器的形態(tài)結構，而共聚焦顯微鏡只能獲取細胞的二維圖像，無法觀測完整的三維結構，所以三維重建將有利于更好地認識細胞。

由于受熒光斷層圖像層間距的限制，為了提高數(shù)據(jù)分辨率，需要進行插值處理來改善細胞的三維可視化的效果。一般而言，斷層圖像的插值方法包括基于灰度的插值方法、基于形態(tài)學的插值方法和基于小波變換的插值方法［7-8］?；谛螒B(tài)學的插值算法是通過已知的斷層圖像的形狀，直接構造出插值圖像的輪廓［9］。由于細胞邊緣不規(guī)則，且具有非線性的特征，所以本文選用形態(tài)學插值算法。

首先，創(chuàng)建起始對象和目標對象作為兩個相鄰的斷層圖像。然后提取各層的邊緣輪廓，創(chuàng)建插值層。兩個斷層圖像之間的插值表明兩層之間的過渡信息，插值的目的是使兩層平滑過渡。

為了比較形態(tài)學的差異，將兩個斷層圖像重疊得到一個具有形態(tài)學差異的圖像，見圖4。Ⅲ是重疊區(qū)，Ⅰ和Ⅱ分別屬于起始對象X1或目標對象X2，這兩個區(qū)域表示斷層圖像之間的形態(tài)學差異。插值運算時，將Ⅱ和Ⅲ之間的邊界向區(qū)域Ⅱ移動，從而使區(qū)域Ⅲ擴大。同樣地，區(qū)域Ⅰ收縮直至最后消失。

為了簡化運算，如圖4，將結構元B的中心移動到x′。B0是在X1外法線方向一側，Bi在內法線方向一側。為了計算每一個插值，用Xn+1代替X2表示目標層，則在起始對象X1和目標對象Xn+1之間共有n-1個插值層，即X2，X3，…，Xn的計算公式：

式中，n為層間距；為第（i-1）層的目標輪廓；為在第（i-1）層的位置x處分別進行膨脹與腐蝕的結構元的大??；和為形態(tài)學差異向量。

圖4 算法原理圖

采用八鄰域方向鏈法跟蹤起始對象的邊緣輪廓，根據(jù)左手定則始終保持起始對象位于跟蹤過程的左側。然后，對于每個鏈單元，可以通過將單元順時針旋轉900定位外法線方向，因此，輪廓上每一點的外法線方向可以通過幾個鄰域鏈單元的外法線方向加權來計算［10］。

已知起始層與目標層的間隙為0.044 μm，采用4層插值，重構的細胞三維結構如圖5所示。

圖5 實驗輸出三維圖像

由于細胞圖像采集時，細胞培養(yǎng)液共聚焦皿中，所以只能采集出細胞為半封閉形態(tài)，重構結果可以看出符合細胞采集時的狀態(tài)。相對于一般的插值法而言，對斷層圖像進行形態(tài)學插值三維重構，可以使兩斷層間創(chuàng)建的插值層圖像從起始層圖像不斷接近于目標層圖像，通過邊緣方向的變化進行形態(tài)學補償有效的使三維結構邊緣平滑并且沒有明顯的層間階梯感。但是由于插值層插入有限，可能會對圖像的邊緣結構進行破壞從而細胞三維結構的精準性還有待提高。

4 結論

目前，激光共聚焦顯微鏡是用于觀察細胞形態(tài)的主要工具，但是它僅能獲取細胞的二維斷層圖像，而無法得到三維結構。本文運用數(shù)字圖像處理技術對采集的二維熒光斷層圖像進行三維重建，實現(xiàn)細胞的三維可視化。

本文通過圖像預處理、圖像分割和圖像三維重建等方法完成細胞外形及內部結構的重構。首先采用數(shù)學形態(tài)學降噪算法對細胞熒光圖像進行降噪處理。相對于常規(guī)算法，比如中值濾波、空間濾波和小波濾波等而言，形態(tài)學方法能夠獲得更好的降噪效果，同時還能保護圖像邊緣的非線性特征，取得更好的邊緣平滑效果。本文通過對比腐蝕、膨脹、開運算和閉運算等幾種形態(tài)學算法的處理結果，從中找出適合細胞的熒光圖像處理的組合濾波器。其次，采用分水嶺算法進行圖像分割。由于細胞邊緣具有非線性特征，常用的線性分割算法無法滿足需要。因此，本文采用形態(tài)學中分水嶺算法進行圖像分割，通過構建水壩與分離集水盆的方式提高分割效果，保持細胞器邊緣完整且不失真。最后，運用形態(tài)學插值的方法對相鄰兩幅圖像進行層間插值實現(xiàn)三維重建，輸出細胞的三維可視化結構。

本文的研究成果將為細胞生物學和生物動力學等方面的研究提供基礎，活細胞的三維可視化技術將大大提高細胞實驗的觀測效果。