吳智華 劉虹

摘要：指出了自主設計型實驗室是培養(yǎng)大學生技能、創(chuàng)新意識和開拓精神的良好方法。植物凝集素對動物紅細胞的凝集反應是細胞生物學實驗教學中的一個基礎實驗，以植物凝集素實驗為例，探討了生物學自主設計型實驗的整體實驗流程及其效果。通過對比常規(guī)的驗證性實驗，發(fā)現(xiàn)了實驗中存在的一些問題，提出了若干改進措施，取得了較好的效果。

關鍵詞：自主設計;植物凝集素;凝集效果

中圖分類號：Q71.2 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）17-0268-02

1引言

高等院校是培養(yǎng)高層次專業(yè)技術人才的主力軍。目前高等院校的實驗課程教學，例如生命科學領域，大多數(shù)都是在理論部分講解以后，根據(jù)理論講解內容，安排一些基礎驗證性實驗或綜合性實驗，學生大多通過固定的實驗流程，在做完實驗并驗證基本結論后通過提交實驗報告而結束。這些實驗對學生加強課程知識的理解有益，但是對于培養(yǎng)大學生的創(chuàng)新意識和創(chuàng)新能力則稍顯不足。如今高等院校培養(yǎng)大學本科生的首要目標和任務是培養(yǎng)復合應用型人才，為了實現(xiàn)這個目標，就要加強對學生技能訓練、創(chuàng)新意識培養(yǎng)和開拓精神的鍛煉，從理論到實踐、從所知向能用的飛躍是現(xiàn)階段高等教育人才培養(yǎng)改革的重要環(huán)節(jié)。自主設計型實驗通過多學科理論知識和實驗技術手段的運用，以培養(yǎng)本科生的創(chuàng)新能力為基本價值取向，來達到培養(yǎng)大學生綜合運用知識和實驗技能的目的。自主設計型實驗要求學生具有一定的專業(yè)知識，通過訓練來培養(yǎng)學生的研發(fā)能力，有意識地在實驗中培養(yǎng)學生的創(chuàng)新意識，為培養(yǎng)創(chuàng)新型人才服務。關于生物學實驗教學，作者多年以來一直努力探索一條提高當代大學生創(chuàng)新型動手能力的教學發(fā)展改革之路，提倡自主設計型實驗模式，本文以細胞生物學實驗課程中的植物凝集素實驗為例，來探討生物學自主設計型實驗的整體實驗流程及其效果，以期提高學生分析問題與解決問題的能力，最終達到創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)的目標。

凝集素（lectin）是一類含糖、并能與糖專一結合的蛋白質，與糖的運輸、儲存物質的積累、細胞間的互作以及細胞分裂的調控有關。凝集素在細胞識別和黏著反應中起重要作用，它使細胞凝集是因為它與細胞表面的糖分子連接，凝集素有一個或多個同糖結合的位點，在細胞間形成“橋”的結果，加入與凝集素互補的糖可以抑制細胞發(fā)生凝集，凝集素與糖結合的活性及專一性決定其功能。植物細胞和動物細胞都能夠合成和分泌凝集素，第一個植物凝集素是在蓖麻籽中發(fā)現(xiàn)的，到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種不同的植物凝集素。大多數(shù)的植物的凝集素存在于儲藏器官中，作為一種氮源。例如，種子來源的凝集素主要分布在子葉、胚乳和胚軸中;非種子來源的凝集素在營養(yǎng)器官如葉片、莖、莖皮、鱗莖、塊莖、球莖、根狀莖、根、果實、花、子房、韌皮部汁液和花蜜中均有;對某些植物而言，受到危害時，凝集素會作為一種防御蛋白發(fā)揮作用。

在通用的細胞生物學實驗中，大多會把植物凝集素對紅細胞的凝集反應作為一個鍛煉學生的驗證性或綜合性實驗。本實驗開設的目的是使學生學習研究細胞凝集反應的方法，了解細胞發(fā)生凝集反應的原因;培養(yǎng)學生自主獲取知識和初步從事科研工作的能力。通過多年的教學實踐，發(fā)現(xiàn)本實驗更適宜于開設成為自主設計型實驗，并根據(jù)學生自主設計實驗過程種發(fā)現(xiàn)的若干問題對實驗進行了改進，取得了較好的結果。對比以往的驗證性實驗，不同之處是學生自主設計實驗流程，對不同的實驗材料采用不同的處理，通過摸索最終獲得滿意的實驗結果，該實驗能夠有效地鍛煉學生的動手能力和綜合素質。

2實驗設計

日常生活中常見的植物例如馬鈴薯、韭菜、黃豆、花生、西紅柿等都含有植物凝集素。本實驗要求學生提前一周自主查閱文獻，每人選用兩種不同的植物材料，并設計實驗流程，提前配制實驗中所需的非常規(guī)試劑;然后統(tǒng)一在實驗課堂上進行操作，有不足之處及時調整、修改自己的實驗方案，完成實驗計劃;最后對實驗結果進行處理與分析，并撰寫正式的實驗報告。

3實驗方法

本實驗要求學生對兩種植物材料，設計不同的方法例如離心、勻漿過濾或者鹽析、過飽和沉淀等獲得含有可溶性植物凝集素的溶液，然后統(tǒng)一用2%的兔血紅細胞來檢驗凝集素的有無，并比較不同植物凝集素對血細胞凝集效果的強弱。

常規(guī)試劑：生理鹽水;磷酸緩沖液;硫酸胺;2%的兔血紅細胞。

2%的兔血紅細胞的制備：以無菌方法抽取兔的靜脈血液（加肝素抗凝劑）用生理鹽水洗5次，每次2000r/min離心5min，最后按紅細胞體積加生理鹽水配成2%兔血紅細胞液。

4問題分析及其改進

4.1紅細胞的選擇

實驗過程中發(fā)現(xiàn)紅細胞的選擇存在兩個問題，首先，兔靜脈血的采集比較困難，第一次開設本實驗的時候，按照常規(guī)講義。選取體型較大的兔子，用一次性注射器抽取兔耳靜脈血，只能獲得少量的靜脈兔血，而且學生人數(shù)較多時需要兔子數(shù)量相應增加，經(jīng)濟成本較大。其次，如果沒有動物房，兔子活體抽血后還需要飼養(yǎng)，耗費成本增加。經(jīng)學生自主性試驗比較后，雞血紅細胞的效果比兔血紅細胞的凝集效果要好，且動脈血與靜脈血區(qū)別不大，取雞頸大動脈血液相對取兔靜脈血而言要容易得多，而且量大，例如100名學生實驗規(guī)模的話，取一只雞的頸動脈血足夠供試驗用，采兔耳靜脈血至少需要3～4只兔子。因此，改進實驗采用雞血紅細胞以后，紅細胞更容易提取且經(jīng)濟成本較低。

4.2生理鹽水與磷酸緩沖液

植物凝集素的提取視植物材料不同而方法各異，學生設計實驗方案的時候可以多方查閱文獻資料并進行比較試驗，例如提取馬鈴薯凝集素的時候可以先將馬鈴薯3～4g剪碎研磨成勻漿，研磨時加入少量的磷酸緩沖液或者生理鹽水，研磨后加入勻漿體積20～30倍的磷酸緩沖液，浸泡約1h，浸出的粗提液中即含有大量馬鈴薯凝集素。常用的細胞生物學實驗教材中提取馬鈴薯凝集素的時候，提到的溶液均為磷酸緩沖液。經(jīng)學生自主性試驗比較后發(fā)現(xiàn)，生理鹽水和磷酸緩沖液處理后得到的植物凝集素具有同等的效果，而生理鹽水相對于磷酸緩沖液而言，配制更為簡單且經(jīng)濟。

4.3硫酸銨飽和度的理解

提取常見植物韭菜葉、西紅柿或者黃豆、花生的凝集素時，其實驗步驟較馬鈴薯復雜，例如韭菜葉勻漿以后要先過濾取上清液，用鹽析法在上清液中加入硫酸銨至60%的飽和度，然后采用2000r/min或者5000r/min的轉速離心兩次，每次15～20min，最后檢測離心后沉淀中植物凝集的有無。實驗過程中發(fā)現(xiàn)學生普遍較難理解硫酸銨的飽和度。而一般實驗教材中也沒有針對硫酸銨的飽和度作具體解釋，只是在教材中寫道提取3～5g韭菜葉并按照1：1（W：V）加入生理鹽水研磨過濾后5000r/min離心兩次，第一次離心后取上清液加硫酸銨至60%的飽和度（約1.8g）。實際上1.8g硫酸銨固體和60%的飽和度的關聯(lián)，學生往往不清楚。因此，換算解釋如下：鹽析法生物分離時一般采用硫酸銨，其分段鹽析效果比其他的鹽好，不容易引起蛋白質變性，參照O℃和25℃兩個溫度下硫酸銨的飽和度計算表，查得初始硫酸銨濃度為零，終飽和度為60%時0℃和25℃兩個溫度下每1mL溶液中分別需要加人硫酸銨固體O：361g和0.39g，如果實驗條件按照O'C的情況計算，3～5g韭菜研磨過濾后得到約3mL的濾液的話，那么加入的硫酸銨固體就約為1.8g。所以教材中這種籠統(tǒng)的寫法并不科學，其次溫度把握也不準確，學生實驗一般在室溫下（25℃）進行。經(jīng)學生自主性探索不同實驗條件后。建議步驟調整如下：稱取3～5g韭菜葉，按照1：1（W：V）加入生理鹽水研磨過濾后5000r/min離心兩次，每次15min，用量筒準確量取第一次離心后的濾液，按照濾液體積與硫酸銨質量比例1：0.39加入硫酸銨固體，然后進行第二次離心。

4.4不同植物凝集素凝集效果的比較

學生在自主設計此次實驗的時候，往往選用的植物材料有馬鈴薯、韭菜葉、花生、黃豆、西紅柿等等。從整體實驗結果來看，上述植物凝集素對2%的雞血紅細胞的凝集效果較好，其中馬鈴薯凝集素的提取方法最為簡單，對雞血紅細胞的凝集效果最好，韭菜、花生次之，黃豆較差。當然，不同植物凝集素對血紅細胞的凝集效果也和凝集素的提取方法密切相關，離心的轉速和離心的時間等都會影響最終的凝集效果。

5結語

植物凝集素對紅細胞的凝集反應是細胞生物學實驗中的一個基礎實驗，以往教材多選用具體的植物材料例如馬鈴薯、韭菜葉、花生中的一種，安排驗證性的實驗設計流程來開展實驗。自我設計型實驗則要求學生先獨立查閱文獻，選用至少2種以上的植物，自己設計實驗方案來提取不同植物的凝集素，驗證和比較這些不同種類的凝集素對紅細胞的凝集效果。針對實驗中出現(xiàn)的問題需要及時調整實驗方案，最終完成實驗任務。不同的植物材料有不同的提取方法，材料的選取、溶液的制備、離心的轉速和離心的時間都需要通過不斷的實驗探索，才能獲得最佳實驗參數(shù)。整體一個實驗結束后，既鍛煉了大學生查閱科學文獻、獨立思考、科學性設計實驗的能力，又培養(yǎng)了他們的綜合動手能力和創(chuàng)新思維意識。這是普通的驗證性實驗所不具備的優(yōu)點，本文以植物凝集素自主設計型實驗為例，探討了不同植物凝集素的提取方法，以及對動物紅細胞凝集效果的比較，并對實驗過程中出現(xiàn)的各種常見問題進行了分析與改進，理論聯(lián)系實際，有利于在今后的細胞生物學實驗教學中更好地推廣這一自主設計型實驗，在掌握相關的理論知識的基礎上，更好地開設這門實驗課程。