陳 暉，丘 琴

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200）

苦玄參，又名蛇總管、魚(yú)膽草、落地小金錢(qián)、四環(huán)素草，為玄參科植物苦玄參Picria felterrae Lour.的干燥全草，分布于廣西、廣東、貴州和云南南部等地，具有清熱解毒、消腫止痛之功效。臨床常用于風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、喉痹、痄腮、脘腹疼痛、痢疾、跌打損傷、癤腫、毒蛇咬傷。電噴霧離子源質(zhì)譜具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、分子離子峰豐度高等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（UPLC-Triple TOF-MS）聯(lián)用技術(shù)初步分析苦玄參的化學(xué)成分，為苦玄參的臨床應(yīng)用提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 色譜儀器為島津LC-30A 超高液相色譜系統(tǒng)：包括二元高壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；質(zhì)譜儀器為AB Sciex Triple TOF 5600+，XEVO G2-S QTOF∕MS質(zhì)譜系統(tǒng)和Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站；SQP電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；優(yōu)普Ulupure 實(shí)驗(yàn)室超純水儀（上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試藥與試劑 實(shí)驗(yàn)用苦玄參全草1批，2018年11月采自廣西梧州，經(jīng)廣西一心醫(yī)藥馬利飛副主任中藥師鑒定為玄參科植物苦玄參Picria felterrae Lour.的干燥全草。甲醇（默克股份兩合公司，批號(hào)：JB034007）；乙腈（色譜純，批號(hào)：JA034131）和甲酸（色譜純，批號(hào)：JC034117）均為默克股份兩合公司產(chǎn)品；95%乙醇（分析純，批號(hào)：170505）為西隴化工股份有限公司產(chǎn)品；甲醇（分析純，批號(hào)：20170920）為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；水為純凈水。

2 方法和結(jié)果

2.1 供試品的制備 稱(chēng)取苦玄參全草1 g，精密稱(chēng)定，加入70%乙醇在90 ℃恒溫水浴中加熱回流1 h，過(guò)濾，濾液置于水浴鍋上蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至2 ml 的容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，將溶液轉(zhuǎn)移到離心管，高速離心10 min（13 000 r∕min），將上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，備用。將樣品放入4 ℃冰箱保存，保存時(shí)間不超過(guò)24 h。

2.2 色譜條件 色譜柱為C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫40 ℃；流速為0.3 ml∕min；進(jìn)樣量為2 μl；流動(dòng)相采用乙腈（B）-0.2%甲酸（A）水溶液的梯度洗脫：0 min（5%B），0.1～37 min（5%～30%B），37.1～40 min（30%～5%B）。

2.3 質(zhì)譜條件 離子化模式為電噴霧正離子模式，離子源電壓分別為5 500 V，離子源溫度為600 ℃，去簇電壓（DP）分別為100 V，碰撞能量（CE）分別為35 eV，碰撞能量擴(kuò)展（CES）分別為15 eV。霧化氣體為氮?dú)?，輔助氣1為60 PSI，輔助氣2 為50 PSI，氣簾氣為40 PSI。一級(jí)質(zhì)譜母離子掃描范圍為50～1 000，IDA 設(shè)置響應(yīng)值超過(guò)100 cps 的6 個(gè)最高峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍為50～1 000，開(kāi)啟動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）。

離子化模式為電噴霧負(fù)離子模式，離子源電壓分別為-4 500 V，離子源溫度為500 ℃，去簇電壓（DP）為100 V，碰撞能量（CE）為-35 eV，碰撞能量擴(kuò)展（CES）為15 eV。霧化氣體為氮?dú)猓o助氣1 為60 PSI，輔助氣2 為50 PSI，氣簾氣為40 PSI。一級(jí)質(zhì)譜母離子掃描范圍為50～1 000，IDA 設(shè)置響應(yīng)值超過(guò)100 cps 的6 個(gè)最高峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍為50～1 000，開(kāi)啟動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）。

3 結(jié)果與討論

3.1 苦玄參供試品溶液的總離子流圖 在ESI正離子模式下，苦玄參供試品溶液的總離子流圖見(jiàn)圖1；在ESI 負(fù)離子模式下，苦玄參供試品溶液的總離子流圖見(jiàn)圖2。

圖1 正離子模式下苦玄參提取物的總離子流圖

圖2 負(fù)離子模式下苦玄參提取物的總離子流圖

3.2 數(shù)據(jù)分析 采用高分辨質(zhì)譜對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的活性成分匹配，定性分析苦玄參中藥活性成分?？嘈⒋继崛∫涸谡?fù)離子模式下共檢測(cè)到33種中藥活性成分，其中響應(yīng)強(qiáng)度大于10 000的中藥活性成分共有19種，其中推測(cè)出10種成分。見(jiàn)表1。

表1 苦玄參的化學(xué)成分分析結(jié)果

化合物1：一級(jí)質(zhì)譜圖中存在離子峰［M-H］-（m∕z 623.1981），理論計(jì)算值為623.1975（calcd for C29H35O15），高分辨質(zhì)譜實(shí)測(cè)獲得的精確質(zhì)量與理論計(jì)算值高度一致，得出此化合物的分子式為C29H36O15；其二級(jí)質(zhì)譜中檢測(cè)到主要碎片離子峰（m∕z 461.1615），（m∕z 161.0000），推測(cè)（m∕z 461.1615）離子是化合物丟失一個(gè)162Da 的咖啡酰基產(chǎn)生的，m∕z161.0000 是咖啡酸負(fù)離子脫水的產(chǎn)物，因此推測(cè)化合物結(jié)構(gòu)有咖啡?；?，結(jié)合文獻(xiàn)［1-2］，推測(cè)該化合物是阿克苷。

化合物2：在提取離子流圖中tR=9.89 min 處還有一個(gè)強(qiáng)度很大的離子峰，對(duì)應(yīng)的一級(jí)質(zhì)譜基峰為［M-H］-（m∕z 623.1981），其理論計(jì)算值為623.1975（calcd for C29H35O15），此化合物的二級(jí)質(zhì)譜裂解的碎片離子與化合物1完全一致，顯示有咖啡酰基的信號(hào)，即化合物2 和化合物1 為同分異構(gòu)體。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，含有不飽和芳香?；捻?lè)串悩?gòu)體在混合溶液中會(huì)互相轉(zhuǎn)化而達(dá)到平衡［1］，故推測(cè)該化合物可能為一對(duì)順?lè)串悩?gòu)體，結(jié)合文獻(xiàn)［1］，推測(cè)該化合物是異阿克苷。

化合物3：一級(jí)質(zhì)譜中存在較強(qiáng)的離子峰［M-H］-（m∕z 487.1464），在負(fù)離子模式下，高分辨質(zhì)譜實(shí)測(cè)獲得的精確質(zhì)量與理論計(jì)算值高度一致，得出此化合物的分子式為C21H28O13，該化合物在二級(jí)質(zhì)譜下裂解的主要碎片離子峰有（m∕z 179.0375），該碎片離子為咖啡酸脫去一個(gè)H+得到，（m∕z 161.0251）為咖啡酸脫去一份子水得到，（m∕z 135.0467）該碎片離子為咖啡酸脫去H-CO2所得，結(jié)合文獻(xiàn)［3-4］，推測(cè)該化合物為肉蓯蓉苷F。

化合物4：在提取離子流圖中tR=30.66 min峰對(duì)應(yīng)的一級(jí)質(zhì)譜基峰為m∕z 455.3539，在負(fù)離子模式下該化合物的［M-H］-離子理論值質(zhì)荷比為（m∕z 455.3531），與實(shí)驗(yàn)測(cè)量值僅相差0.00353 Da，根據(jù)元素組成和參考文獻(xiàn)，推測(cè)該化合物分子式為C30H48O3，該化合物在負(fù)離子模式下比較穩(wěn)定，沒(méi)有裂解的二級(jí)質(zhì)譜，故推測(cè)該化合物為齊墩果酸［5］。根據(jù)文獻(xiàn)［3］可知齊墩果酸廣泛存在于玄參科多種植物中。

化合物5：該化合物是在正離子模式下裂解，化合物一級(jí)質(zhì)譜圖存在正離子［M+H］+（m∕z 457.3671），因此計(jì)算出分子式為C30H48O3，根據(jù)文獻(xiàn)［5］，該化合物在正離子模式下不穩(wěn)定，極易發(fā)生裂解，主要碎片離子有m∕z 439.3576，m∕z 233.1897，m∕z 421.3468，m∕z 201.1633，m∕z 149.1329 等。其二級(jí)質(zhì)譜中豐度較大的碎片離子（m∕z 439.3576），是由準(zhǔn)分子離子（m∕z 457.3671）失去一分子水形成。結(jié)合文獻(xiàn)［6］，推測(cè)該化合物是熊果酸，是齊墩果酸的同分異構(gòu)體，該化合物廣泛存在于玄參科多種植物中。

化合物6：該化合物在負(fù)離子模式下發(fā)生裂解，其一級(jí)質(zhì)譜圖存在較強(qiáng)離子峰［M-H］-（m∕z 651.2297），其理論計(jì)算值為651.2288（calcd forC31H40O15），與實(shí)驗(yàn)測(cè)量值僅相差0.0009 Da。二級(jí)質(zhì)譜中檢測(cè)到的碎片離子峰（m∕z 475.1781）［M-H-Feruloyl］-為化合物脫掉阿魏酸所得，（m∕z 193.0520）［M-H-HMP］-，（m∕z 175.0418）［M-HHMP-H2O］-，這些碎片離子峰與文獻(xiàn)［10］報(bào)道一致，故推測(cè)該化合物是地黃苷，地黃苷廣泛存在于玄參科多種植物中［11］。

化合物7：該化合物在負(fù)離子模式下裂解，一級(jí)質(zhì)譜中存在負(fù)離子［M-H］-（m∕z 761.4126），因此計(jì)算出分子式為C41H62O13，化合物的二級(jí)質(zhì)譜中存在碎片離子（m∕z 675.3328）、（m∕z 615.3530）、（m∕z 529.2802），其中碎片離子（m∕z 615.3530）［M-146-H］-提示分子中存在一個(gè)鼠李糖，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報(bào)道苦玄苷A1 的MS 的數(shù)據(jù)一致［1］，故推測(cè)該化合物為苦玄苷A1?？嘈誂1 是苦玄參重要的有效成分［7］。

化合物8：該化合物在正離子模式下發(fā)生裂解，其一級(jí)質(zhì)譜圖中存在較強(qiáng)離子峰［M+H］+（m∕z 271.0607），其理論值（m∕z 271.1348），高分辨質(zhì)譜實(shí)測(cè)獲得的精確質(zhì)量與理論計(jì)算值高度一致，因此得出此化合物的分子式為C15H10O5，其二級(jí)質(zhì)譜中檢測(cè)到碎片離子（m∕z 243.0656）、（m∕z 153.0186）與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致［1］，故推測(cè)該化合物為芹菜素，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，芹菜素是苦玄參中的主要成分之一，能在苦玄參的醇提液中檢測(cè)到該化合物［2，7］。

化合物9：該化合物在正離子模式下發(fā)生裂解，一級(jí)質(zhì)譜中存在離子峰［M+H］+（m∕z 443.3879），其理論值（m∕z 443.3884），實(shí)驗(yàn)測(cè)得值與理論值高度一致，故該化合物的分子式為C30H50O2，在二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)到重要碎片離子（m∕z 425.3759）［M+H-H2O］+；（m∕z 203.1783）［M+H-C15H26OH2O］+與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的相關(guān)數(shù)據(jù)一致，故推測(cè)該化合物為白樺脂醇。白樺脂醇是苦玄參種子的成分之一［9］。

化合物10：該化合物在正離子模式下發(fā)生裂解，其一級(jí)質(zhì)譜中存在較強(qiáng)離子峰［M+H］+（m∕z 483.3103），計(jì)算出其分子式為C30H42O5，二級(jí)質(zhì)譜中檢測(cè)到的碎片離子峰（m ∕z 325.2151）為［M+H-C8H11O2-H2O］+所 得，（m ∕z 307.2045）為［M+H-C8H11O2-H2O-CH3-H］+所得，（m∕z 189.1266）為［M+H-C17H26O4］+所得，上述碎片離子峰與文獻(xiàn)［12］報(bào)道一致，故推測(cè)該物質(zhì)為苦玄參酮1。

4 小 結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)苦玄參的醇提物進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)提取物中含有三萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜苷類(lèi)和多種苯丙酸（如肉桂酸、咖啡酸等），以及葡萄糖、鼠李糖等縮合成苷化合物，因而同系物較多。通過(guò)主要離子峰和碎片離子峰信息，推測(cè)出其中10種化合物。

本實(shí)驗(yàn)鑒定的化合物大多數(shù)源于對(duì)已知化合物的篩查，對(duì)未知化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)仍較為困難，尤其是同分異構(gòu)體及同系物，需要結(jié)合C譜、H譜等技術(shù)進(jìn)一步分析，以獲得化合物的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)可為苦玄參的化學(xué)成分研究提供依據(jù)，也可為苦玄參的臨床應(yīng)用提供參考。