陳星，戢敏，喻雪琴，陳芳，梅怡晗，梅小平

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 感染科，四川 南充 637000；2.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

手足口?。╤and foot and mouth disease, HFMD）是兒科的一種常見傳染病，主要由腸道病毒感染所致，具有傳染性強(qiáng)、傳播快的臨床特點(diǎn)。絕大多數(shù)患兒病情呈自限性發(fā)展，少數(shù)患兒可發(fā)展至重型HFMD。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，HFMD的發(fā)生機(jī)制與細(xì)胞免疫功能異常和相關(guān)細(xì)胞因子水平失衡相關(guān)[1-3]。筆者就HFMD患兒循環(huán)血T巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、白細(xì)胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）、白細(xì)胞介素-17（Interleukin-10, IL-17）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis facto, TNF-α）表達(dá)水平的變化進(jìn)行臨床研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016年1月—2018年6月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的68例HFMD患兒作為觀察組。其中，男性42例，女性26例；年齡（3.12±1.28）歲；根據(jù)臨床病情程度：普通型42例，重癥型26例。HFMD診斷符合2010年國家衛(wèi)計(jì)委辦公廳頒布的《手足口病診療指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)及分型[4]。隨機(jī)選取同期門診健康體檢的25例兒童作為對(duì)照組。其中，男性17例，女性8例；年齡（3.27±1.21）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

收集HFMD患兒循環(huán)靜脈血標(biāo)本、年齡、性別、病史、癥狀、體征及輔助檢查等臨床資料；同時(shí)檢測HFMD患兒、對(duì)照組兒童的循環(huán)靜脈血病原學(xué)、T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、IL-10、IL-17及TNF-α的表達(dá)水平。

1.3 標(biāo)本采集

觀察組在入院隔日清晨、對(duì)照組兒童在體檢時(shí)清晨抽取循環(huán)血標(biāo)本2 ml置于EDTA抗凝的試管內(nèi)，循環(huán)靜脈血標(biāo)本離心后血清在≤-20℃低溫冷凍保藏，血清檢測采用中和抗體測定法。具體檢測方法依據(jù)衛(wèi)生部《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[5]。

1.4 病毒學(xué)檢測

采用美國ABi公司的ABI7300熒光定量PCR儀和江蘇默樂生物科技有限公司生產(chǎn)的EV71、CoxA16及通用型腸道病毒核酸檢測試劑盒，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測EV、腸道病毒71（Enterovirus-71, EV-71）及CA16等腸道病毒RNA，嚴(yán)格按照說明書由專人進(jìn)行操作。

1.5 循環(huán)血T細(xì)胞亞群檢測

以美國BD公司生產(chǎn)的FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞亞群，取觀察組與對(duì)照組的循環(huán)靜脈血2 ml EDTA-K2抗凝。在各試管中加入10μl由CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC和CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC組成的4標(biāo)記單克隆抗體，同時(shí)加入100μl抗凝循環(huán)靜脈血混勻并標(biāo)記30 min，加入固定劑30μl固定5～10 min；加入紅細(xì)胞溶解液1 ml溶解紅細(xì)胞10～20 min，最后加磷酸鹽緩沖液后用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)10 000個(gè)淋巴細(xì)胞并進(jìn)行分檢。

1.6 循環(huán)血清細(xì)胞因子IL-10、IL-17及TNF-α水平檢測

采集觀察組和對(duì)照組循環(huán)靜脈血2 ml，離心后留取血清在≤-20℃低溫冷凍保藏，采用美國ADLD公司試劑盒及Rayto RT-6100型酶標(biāo)儀，酶聯(lián)免疫法檢測血清IL-10、IL-17及TNF-α水平。

1.7 治療后T細(xì)胞亞群及炎癥因子的檢測

入院治療后第7天清晨再次抽取循環(huán)靜脈血標(biāo)本2 ml置于含EDTA抗凝的試管內(nèi)，循環(huán)靜脈血標(biāo)本離心后血清在≤-20℃低溫冷凍保藏，其T細(xì)胞亞群及血清細(xì)胞因子IL-10、IL-17及TNF-α的檢測方法、試劑與檢測人員等與入院初次檢測一致。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組性別、年齡比較，經(jīng)t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 HFMD腸道病毒感染分布及構(gòu)成比分析

68例HFMD患兒腸道病毒感染以單一病毒最為常見；其中EV-71構(gòu)成比最高，EV-71+CA16構(gòu)成比位居第2位。所有病毒感染后的RNA檢測為陽性。見表2。

表2 HFMD患兒腸道病毒感染分布及構(gòu)成比

2.3 兩組治療前細(xì)胞免疫功能及相應(yīng)細(xì)胞因子水平

兩組治療前CD4+T、CD8+T及NK細(xì)胞水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組CD4+T、CD8+T及NK細(xì)胞水平低于對(duì)照組（P＜0.05）。兩組治療前IL-10、IL-17及TNF-α水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組IL-10、IL-17及TNF-α水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表3。

2.4 不同病情程度HFMD患兒細(xì)胞免疫功能及相應(yīng)細(xì)胞因子水平

重型HFMD組與普通型HFMD組治療前CD4+T、CD8+T及NK細(xì)胞水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；重型HFMD組CD4+T、CD8+T水平低于普通型HFMD組，而NK細(xì)胞水平高于普通型HFMD組（P＜0.05）。重型HFMD組與普通型HFMD組IL-10、IL-17及TNF-α水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），重型HFMD組IL-10、IL-17及 TNF-α 高 于 普 通 型 HFMD 組（P＜0.05）。見表4。

2.5 觀察組治療前后循環(huán)血細(xì)胞免疫功能及相應(yīng)細(xì)胞因子水平變化

觀察組治療7 d后與治療前CD4+T、CD8+T、NK細(xì)胞水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后CD4+T、CD8+T及NK細(xì)胞水平較治療前高（P＜0.05）。觀察組治療 7 d 后與治療前的IL-10、IL-17及TNF-α水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后的IL-10、IL-17濟(jì) TNF-α水平較治療前低（P＜0.05）。見表5。

表3 兩組治療前細(xì)胞免疫功能及相應(yīng)細(xì)胞因子水平比較 （±s）

表3 兩組治療前細(xì)胞免疫功能及相應(yīng)細(xì)胞因子水平比較 （±s）

組別 n CD4+T/% CD8+T/% NK 細(xì)胞 /% IL-10/（pg/ml） IL-17/（pg/ml） TNF-α/（pg/ml）對(duì)照組 25 40.551±1.282 22.570±3.322 9.692±1.232 25.352±1.784 26.253±1.771 1.874±0.223觀察組 68 34.542±2.363 17.522±2.091 8.463±1.554 33.764±4.143 35.854±3.933 3.473±0.504 t值 16.323 8.223 3.614 13.132 15.501 20.543 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 不同病情程度HFMD患兒細(xì)胞免疫功能及相應(yīng)細(xì)胞因子水平比較 （±s）

表4 不同病情程度HFMD患兒細(xì)胞免疫功能及相應(yīng)細(xì)胞因子水平比較 （±s）

組別 n CD4+T/% CD8+T/% NK細(xì)胞/% IL-10/（pg/ml） IL-17/（pg/ml） TNF-α/（pg/ml）普通型HFMD組 42 45.124±1.734 26.014±1.234 3.154±0.253 30.881±1.972 33.243±2.401 3.133±0.284重型 HFMD 組 26 20.081±1.323 20.454±2.243 18.423±1.684 38.422±1.724 40.082±1.353 4.033±0.154 t值 63.232 11.553 46.094 16.093 15.023 17.092 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表5 觀察組治療前后循環(huán)血細(xì)胞免疫功能及相應(yīng)細(xì)胞因子水平變化 （n =68，±s）

表5 觀察組治療前后循環(huán)血細(xì)胞免疫功能及相應(yīng)細(xì)胞因子水平變化 （n =68，±s）

時(shí)間 CD4+T/% CD8+T/% NK細(xì)胞/% IL-10/（pg/ml） IL-17/（pg/ml） TNF-α/（pg/ml）治療前 34.542±2.358 17.502±2.091 8.462±1.545 33.763±4.143 35.852±3.931 3.473±0.502治療后 37.382±1.683 22.471±3.320 9.572±1.733 27.622±2.174 28.724±1.991 1.853±0.192 t值 8.062 10.441 3.962 11.294 13.334 25.002 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

HFMD是兒童中常見的一種傳染性疾病，臨床以發(fā)熱、手掌、足、臀及口腔等多部位皮疹為特征，其主要由EV71、CA16等20多種人腸道病毒感染所致。近5年來，在中國乃至全世界EV-71型腸道病毒已成為最常見的HFMD病原體。EV-71感染后，HFMD患兒可呈現(xiàn)自限性痊愈，重癥化時(shí)常出現(xiàn)肺部感染、心肺功能衰竭甚至死亡[6-8]。為此，探索HFMD的發(fā)病機(jī)制顯得尤其重要。分析68例HFMD患兒后筆者發(fā)現(xiàn)，以單一EV-71感染最為常見；其次為EV-71+CA16的混合感染，這與朱其榮等[9]報(bào)道相一致。

目前，HFMD的發(fā)病機(jī)制不詳，有學(xué)者認(rèn)為，可能與患兒在感染EV-71、CA16等后機(jī)體出現(xiàn)免疫功能失衡與紊亂相關(guān)[10]。機(jī)體細(xì)胞免疫調(diào)控作用可通過CD8+T淋巴細(xì)胞直接殺傷病毒，也可通過CD4+T淋巴細(xì)胞活化B淋巴細(xì)胞來增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)來抑制病毒。CD4+T、CD8+T及NK細(xì)胞在機(jī)體免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究顯示，觀察組患兒治療前CD4+T、CD8+T及NK細(xì)胞水平較對(duì)照組低，表明EV-71感染后，HFMD患兒出現(xiàn)細(xì)胞免疫功能紊亂，大量的CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞發(fā)揮抗病毒效應(yīng)后通過Fas/FasL通路來誘導(dǎo)免疫細(xì)胞出現(xiàn)了程序性凋亡[11-12]。隨著HFMD患兒病情加重，重型HFMD患兒CD4+T、CD8+T細(xì)胞水平較普通型HFMD下調(diào)明顯，表明在HFMD重癥化時(shí)，免疫細(xì)胞活化，大量免疫細(xì)胞耗竭；CD4+T、CD8+T表達(dá)頻率下調(diào)，病毒的清除能力下降，導(dǎo)致疾病重癥化，這與符青松等[13]和BENNETT等[10]研究結(jié)果一致。

有研究顯示，患兒感染EV-71后，機(jī)體會(huì)釋放各種細(xì)胞因子來誘導(dǎo)機(jī)體特異性或非特異性炎癥的發(fā)生，同時(shí)對(duì)病毒發(fā)揮清除與抑制作用，最大限度地促進(jìn)疾病痊愈[14]。在機(jī)體免疫功能低下時(shí)，大量促炎癥因子釋放誘導(dǎo)組織損傷，導(dǎo)致疾病重癥化。本研究顯示，觀察組患兒IL-10、IL-17及TNF-α表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào)，表明HFMD患兒在感染EV-71等病毒后，活化的T淋巴細(xì)胞釋放大量IL-17、TNF-α等促炎癥因子，機(jī)體通過免疫反應(yīng)抗病毒的同時(shí)也導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，這與李宏波等[15]結(jié)果一致。IL-10是抑炎因子代表，能抑制機(jī)體促炎因子的釋放，減輕細(xì)胞氧化反應(yīng)，抑制T細(xì)胞活化增殖。本結(jié)果顯示，觀察組抑炎因子IL-10較對(duì)照組升高，表明HFMD患兒被EV-71感染后，機(jī)體為減輕自我損傷會(huì)同時(shí)釋放抑炎因子來維持促炎因子與抑炎因子的平衡。一旦促炎性因子與抑炎因子比例失衡時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致HFMD重癥化，這與孫林春[11]的研究結(jié)果相似。經(jīng)過治療，在病程第7天觀察組CD4+T、CD8+T及NK細(xì)胞水平較治療前高，而IL-10、IL-17及TNF-α水平較治療前低，表明HFMD患兒在病情好轉(zhuǎn)時(shí)，T淋巴細(xì)胞可回升至常態(tài)，細(xì)胞免疫功能由紊亂趨向平衡；同時(shí)抑制IL-10、IL-17及TNF-α下降，糾正機(jī)體免疫紊亂與細(xì)胞因子水平的失衡狀態(tài)。

綜上所述，患兒免疫功能紊亂與細(xì)胞因子水平失衡在HFMD的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，但確切的HFMD發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究[16-17]。因此，通過上述指標(biāo)檢測對(duì)手足口病的病情及預(yù)后判斷可能有一定的指導(dǎo)作用。