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        大腸癌中自噬相關(guān)蛋白與JAK2/STAT3信號(hào)通路的相關(guān)性

        2019-11-22 01:49:56

        (嘉興市第二醫(yī)院 腫瘤外科,浙江 嘉興 314000)

        細(xì)胞自噬是真核生物普遍存在的一種自穩(wěn)機(jī)制,在細(xì)胞自我保護(hù)、胚胎發(fā)育及生物生存等機(jī)體正常生理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。自噬失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[1],近年來大量研究表明自噬參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展,但其具體機(jī)制尚不明確[2-3]。JAK2/STAT3信號(hào)通路在大腸癌的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等過程中均發(fā)揮重要作用[4]。本文通過研究自噬相關(guān)蛋白與JAK2/STAT3信號(hào)通路在大腸癌中的相關(guān)性,為探索大腸癌的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

        1 資料與方法

        1.1 資料

        收集2015年7月-2016年12月嘉興市第二醫(yī)院腫瘤外科大腸癌患者手術(shù)切除標(biāo)本93例。根據(jù)2010年WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[5],患者均經(jīng)病理學(xué)專家檢查確認(rèn)。其中,男性51例,女性42例;年齡25~83歲,平均(62.18±6.39)歲;腫瘤直徑≥5 cm 59例,<5 cm 34例;發(fā)病部位:結(jié)腸38例,直腸55例;腫瘤分化程度:高分化29例,中分化46例,低分化18例;組織類型:管狀腺癌78例,黏液腺癌15例;浸潤深度:黏膜及黏膜下層3例,肌層11例,外膜79例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例。大腸癌標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本取材分別在癌灶中央的非壞死區(qū)和遠(yuǎn)離癌組織5 cm的區(qū)域,經(jīng)過4%多聚甲醛溶液固定24 h,采用免疫組織化學(xué)法檢測。患者均為首次發(fā)現(xiàn),患者術(shù)前未行任何放化療、靶向治療等抗腫瘤治療。

        1.2 試劑

        兔抗人LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3均購自美國Cell Signal Technology公司,免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 免疫組織化學(xué)法檢測采取免疫組織化學(xué)法檢測LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3在大腸癌組織,以及癌旁組織中的表達(dá),具體步驟如下:脫蠟水化,梯度酒精水化,3%過氧化氫H202孵育15 min,PBS沖洗3次,放入pH值6.0的拘椽酸鈉緩沖液中,在100℃高壓鍋內(nèi)1 min暴露抗原,PBS沖洗3次,添加適量聚合物輔助劑孵育20 min,PBS沖洗3次,DAB試劑盒顯色,充分清洗,蘇木精復(fù)染,自來水沖洗,鹽酸酒精分化1 s,自來水沖洗,氨水返藍(lán),自來水沖洗,二甲苯處理3次,中性樹膠封片。

        1.3.2 結(jié)果判定LC3、p62及p-JAK2陽性著色部位位于細(xì)胞質(zhì),在每張切片上隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(400倍),每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞比例進(jìn)行結(jié)果判斷。著色強(qiáng)度:不著色計(jì)0分,淡黃色計(jì)1分,棕黃色計(jì)2分,黃褐色計(jì)3分;陽性細(xì)胞比例≤5%計(jì)0分,>5%~25%計(jì)1分,>25%~50%計(jì)2分,>50%~75%計(jì)3分,>75%計(jì)4分。將著色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞比例評(píng)分乘積作為最終評(píng)分結(jié)果,≥4分為陽性表達(dá),<4分為陰性表達(dá)。p-STAT3陽性著色位于細(xì)胞核,以細(xì)胞核呈棕黃色為陽性標(biāo)志,計(jì)算陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞百分比,將陽性細(xì)胞百分比≥50%作為高表達(dá)組,<50%作為低表達(dá)組。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,比較用χ2檢驗(yàn),相關(guān)分析用Spearman法,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 不同組織中LC3、p62的表達(dá)及其與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

        LC3和p62主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,為黃褐色或棕褐色顆粒(見圖1),大腸癌與癌旁組織中LC3陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),大腸癌高于癌旁組織。不同分化程度LC3陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),高、中分化低于低分化。有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者LC3陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。見表1、2。

        大腸癌與癌旁組織p62陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),大腸癌組織低于癌旁組織。不同分化程度患者p62陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),高、中分化高于低分化。有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者p62陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。LC3、p62表達(dá)情況與患者性別、年齡、腫瘤直徑及腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)。見 1、2。

        圖1 大腸癌及其癌旁組織中自噬相關(guān)蛋白和STAT3信號(hào)通路的表達(dá) (免疫組織化學(xué)×400)

        2.2 不同組織中JAK/STAT3通路相關(guān)分子的表達(dá)及其與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

        p-JAK2陽性表達(dá)染色主要定位于細(xì)胞漿(見圖1)。大腸癌與癌旁組織p-JAK2陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),大腸癌高于癌旁組織。p-JAK2的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤直徑和腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)。不同分化程度患者p-JAK2陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),高、中分化低于低分化。有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者p-JAK2陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。見表1、2。

        p-STAT3陽性表達(dá)染色主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿(見圖1)。大腸癌與癌旁組織中p-STAT3陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),大腸癌高于癌旁組織。p-STAT3的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤直徑和腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)。不同分化程度p-JAK2陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),高中分化低于低分化。有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者p-JAK2陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。見表2。

        表1 大腸癌與癌旁組織的LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3陽性率比較 [n =93,例(%)]

        表2 不同因素大腸癌患者LC3、p62、p-JAK2和p-STAT3陽性率比較 例(%)

        續(xù)表2

        2.3 自噬相關(guān)蛋白與JAK2/STAT3信號(hào)通路的相關(guān)性

        大腸癌中自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)與p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)均呈正相關(guān)(rs=0.315和0.295,P=0.001和0.003), 而p62的表達(dá) 與p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.320和-0.326,均P=0.001)。見表3。

        表3 LC3、p62與p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)的相關(guān)性 例

        3 討論

        自噬與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),其在腫瘤發(fā)展中的作用也越來越受到重視。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3作為哺乳動(dòng)物自噬體形成,以及胞漿到空泡靶向囊泡所必需的一種蛋白,常用來作為自噬體的標(biāo)志性蛋白之一,微管相關(guān)蛋白1輕鏈3表達(dá)情況可在某些程度上反映自噬體數(shù)量[6]。自噬過程中,p62蛋白與待降解蛋白結(jié)合,并包裹到自噬體中,然后被特異性降解,因此p62蛋白的表達(dá)與自噬活性呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示大腸癌中LC3陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織,而p62在大腸癌中的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織,且隨著癌組織的分化程度越低,LC3陽性表達(dá)升高而p62陽性表達(dá)率降低。表明大腸癌組織中的自噬水平明顯高于癌旁組織,且自噬水平與癌組織的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),組織分化程度越低,自噬水平越高;且出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者自噬水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,這與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果相一致[7]。

        JAK2-STAT3信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、生長、分化及凋亡過程中發(fā)揮重要作用,是一條與多種腫瘤的形成和發(fā)展關(guān)系密切的信號(hào)通路[8-12]。有研究表明,JAK2/STAT3信號(hào)通路在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn),p-JAK2和p-STAT3在大腸癌中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織,且與組織分化程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),p-JAK2和p-STAT3在高、中分化癌組織中的陽性表達(dá)率低于低分化癌組織,在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織,表明JAK2-STAT3信號(hào)通路的高表達(dá)可能與大腸癌的惡性程度有關(guān),這些結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[14]。

        多項(xiàng)研究結(jié)果表明,JAK2/STAT3信號(hào)通路與癌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)[15-17]。多種腫瘤中發(fā)現(xiàn),敲除JAK2可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[18-20]。因此推測,大腸癌中自噬相關(guān)蛋白與JAK2/STAT3信號(hào)通路可能存在關(guān)聯(lián)。本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),大腸癌組織中LC3的表達(dá)與p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)均呈正相關(guān),p62的表達(dá)與p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。提示大腸癌中自噬活性的升高與JAK2/STAT3信號(hào)通路密切相關(guān)。

        綜上所述,在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中,自噬相關(guān)蛋白與JAK2/STAT3信號(hào)通路通過內(nèi)在的分子機(jī)制相互協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)化,使細(xì)胞向惡性方向發(fā)展。因此,對(duì)兩者的深入研究有利于揭示大腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的分子機(jī)制,為早期發(fā)現(xiàn)、治療大腸癌提供新的理論依據(jù)。后續(xù)研究需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,以獲得更為可靠的研究數(shù)據(jù)。

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