吳宏娟，劉玉良，梁雨桐，沈富軍，侯蓉，彭銳*

(1.四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065； 2.成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室，四川省大熊貓科學研究院，成都610081)

大熊貓Ailuropodamelanoleuca是我國特有的瀕危物種之一。由于棲息地破壞、遺傳物質(zhì)流失、自身繁殖率低下等一系列問題，大熊貓的生存一直受到威脅(Shenetal.，2010；李靜，2017；Kang &Li，2018)。近年來，大熊貓的生理、行為生態(tài)學和再生生物學取得了很大的進步，但由于研究材料受限，對大熊貓基因功能的研究相對較少，這也限制了對大熊貓基因調(diào)控網(wǎng)絡的深入認識(Zhangetal.，2008；Shenetal.，2010；Weietal.，2015；Kangetal.，2017)。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞。由于這一特性，MSCs在再生醫(yī)學和組織工程中備受關注(Wangetal.，2012)。Liu等(2013)已成功從大熊貓骨髓中分離出了MSCs，這為大熊貓細胞水平及細胞中不同生物進程的研究提供了原材料。但是關于大熊貓MSCs的細胞周期、生長、分化等生物進程的調(diào)控機制仍不清楚。

Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)是KLF家族中的一員(Schuhetal.，1986)，是一個重要的鋅指轉(zhuǎn)錄因子。KLF4的C端含有3個C2H2鋅指結構，通過這3個鋅指結構與靶DNA或蛋白結合，并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄(Ghaleb &Yang，2017；Yangetal.，2017)。已有研究表明，KLF4在細胞生長、分化和正常組織穩(wěn)態(tài)維持等細胞過程中發(fā)揮重要作用(Zhangetal.，2013；Shatatetal.，2014；Mallipattuetal.，2016；Ghaleb &Yang，2017)。同時，KLF4在誘導多能干細胞中也發(fā)揮著重要的作用(Takashietal.，2008)。Li等(2010)完成了大熊貓參考基因組的測序并公布了該基因組，但是，到目前為止，大熊貓Klf4基因的序列尚未得到實驗驗證。研究KLF4的特性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能將有助于我們進一步了解大熊貓MSCs的增殖、分化及凋亡的分子機制。

為了進一步探究大熊貓Klf4基因的結構和功能，本文通過cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術克隆獲得了大熊貓Klf4基因的cDNA全長序列，并分析了其結構特征。此外，本文還通過病毒感染的方法實現(xiàn)在大熊貓MSCs中過表達KLF4，并通過RNA-seq方法進一步探索了KLF4在大熊貓MSCs中的功能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大熊貓MSCs以及睪丸、大腦、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟組織由成都大熊貓繁育研究基地提供。實驗所用EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞購自成都諾維贊生物科技有限公司，慢病毒載體pLKO.3G、psPAX2以及pMD2.G購自Addgene。

1.2 實驗試劑

細胞培養(yǎng)基購于美國HyClone；胎牛血清、青霉素/鏈霉素混合物、細胞生長因子購于美國Invitrogen；β-actin抗體、FLAG抗體購于成都正能生物有限公司；二抗(山羊抗鼠抗體、山羊抗兔抗體)購于美國Proteintech。RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit購于日本TaKaRa；質(zhì)粒小量提取試劑盒購于天根生化試劑(北京)有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于成都擎科梓熙生物技術有限公司；ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit購于南京諾維贊生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大熊貓MSCs的培養(yǎng)大熊貓MSCs生長所需的低糖培養(yǎng)基包含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素、10 ng·mL-1表皮生長因子(Invitrogen)、5 ng·mL-1堿性成纖維細胞生長因子和7.5 mmol·mL-1谷氨酰胺-1(Invitrogen)。細胞在37 ℃，5%CO2濃度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2Klf4基因的克隆從大熊貓MSCs中提取RNA并根據(jù)SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit的說明書反轉(zhuǎn)錄獲得3’RACE和5’RACE的cDNA模板，然后通過基因特異性引物3’outer-KF、3’inner-KF和5’outer-KF，5’inner-KF與RACE通用引物進行巢式PCR(引物序列見表1)。PCR程序如下：94 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，70～60 ℃(每次循環(huán)遞減0.5 ℃)，72 ℃ 1 min，20個循環(huán)；98 ℃ 30 s，57～65 ℃溫度梯度30 s，72 ℃ 1 min，10個循環(huán)；72 ℃ 5 min。獲得Klf4基因的3’末端和5’末端產(chǎn)物，經(jīng)純化后進行TA克隆并測序。

1.3.3Klf4基因的序列分析將Klf4基因的3’末端和5’末端產(chǎn)物拼接后通過NCBI BLAST在線程序進行核苷酸和氨基酸序列同源性分析；用SWISS-MODEL對KLF4的氨基酸序列特點進行分析，并通過I-TASSER預測其蛋白質(zhì)三維結構(Zhang，2008；Ambrishetal.，2010；Yangetal.，2015)；通過MEGA 7.0構建系統(tǒng)進化樹以分析大熊貓Klf4基因與其他物種的親緣關系，基于KLF4的蛋白編碼區(qū)(coding sequence，CDS)的核苷酸序列，采用鄰接法，bootstrap重復1 000次計算各分支的置信度，各物種GenBank登錄號為：人Homosapiens(NM_001314052.1)、家鼠Musmusculus(NM_010637.3)、狗Canislupusfamiliaris(XM_005626996.2)、黑猩猩Pantroglodytes(XM_01696 1392.2)、綠猴Chlorocebussabaeus(XM_0079684 89.1)、牛Bostaurus(NM_001105385.1)、獼猴Macacamulatta(NM_001142793.2)、野豬Susscrofa(NM_001031782.2)、非洲爪蟾Xenopustropicalis(NM_001017280.2)、家雞Gallusgallusdomesticus(XM_00 4949369.3)、兔Oryctolaguscuniculus(XM_017347 259.1)、貓Feliscatus(NM_001173444.3)、褐家鼠Rattusnorvegicus(NM_053713.1)、羊Ovisaries(NM_001164219.1)、北極熊Ursusmaritimus(XM_008708 038.1)(Kumaretal.，2016)。

1.3.4Klf4基因過表達載體的構建以獲得的3’RACE cDNA為模板，通過引物Full-length-Fw和Full-length-Rv經(jīng)PCR擴增獲得Klf4基因的CDS序列。以此為模板，再次通過PCR擴增的方法在KLF4 CDS的N端和C端分別加上1×FLAG標簽和自剪切肽P2A序列。將獲得的融合片段通過同源重組的方法克隆到酶切后的pLKO.3G載體中，組成慢病毒重組載體pLKO.Klf4。

表1 Klf4克隆及載體構建引物序列Table 1 Primer sequences used for Klf4 cloning and plasmid construction

1.3.5 KLF4重組慢病毒的產(chǎn)生及目的細胞的感染在293T細胞密度達到80%～90%時，通過脂質(zhì)體將10 μg目的質(zhì)粒、7.5 μg psPAX2以及2.5 μg pMD2.G轉(zhuǎn)染入293T細胞中。轉(zhuǎn)染后48 h和72 h時，分別收集病毒上清。病毒經(jīng)濃縮后感染大熊貓MSCs。每8 h感染一次，共感染3次。

1.3.6 實時熒光定量PCR(qPCR)和Western blot分析取大熊貓睪丸、大腦、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟組織，放入液氮中研磨，按照Trizol法提取總RNA，后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser分別將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過qPCR來檢測目的基因及Klf4基因在大熊貓不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平表達情況。qPCR(引物序列見表2)的反應程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt的方法進行計算、分析結果。

在大熊貓MSCs中過表達了KLF4后，通過Western blot來檢測KLF4的表達情況。收集感染pLKO.Klf4和pLKO.3G的細胞樣品，經(jīng)裂解液裂解變性后，用12%SDS-PAGE蛋白膠進行電泳，后經(jīng)轉(zhuǎn)膜、室溫封閉后于4 ℃進行一抗過夜孵育。隔天，3次洗膜后，在室溫下進行二抗孵育，1 h。洗膜后，通過蛋白質(zhì)凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白條帶。

表2 qPCR所用引物Table 2 Primer sequences used for qPCR

1.3.7 RNA-Seq收集過表達KLF4的大熊貓MSCs和對照組pLKO.3G MSCs樣品，由北京百邁克生物技術有限公司完成轉(zhuǎn)錄組測序分析工作。cDNA文庫測序工作在Illumina Hiseq Xten平臺上進行，使用FASTQC進行質(zhì)量監(jiān)控，獲得了高質(zhì)量的clean。通過Tophat2將這些clean與參考基因組序列比對，比對上的reads利用String Tie進行組裝。然后使用EBseq進行差異分析，將滿足篩選條件(錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.01和差異倍數(shù)>2)的差異表達基因進行KEGG富集分析。

2 結果

2.1 Klf4基因的克隆與序列分析

大熊貓Klf4基因cDNA的全長為2 431 bp，其中，5’UTR長60 bp，3’UTR長934 bp，CDS長1 437 bp，編碼479個氨基酸，分子質(zhì)量約為51.9 kDa(GenBank登錄號：MK075241)。Klf4基因的poly A尾上游18 bp處有1個多聚腺苷酸化信號(AATAAA)(圖1：A)。KLF4蛋白的N端沒有發(fā)現(xiàn)信號肽，C端則包含3個保守的C2H2鋅指結構，分別位于氨基酸395～424、425～454、455～478處。此外，KLF4中還存在1個富含絲氨酸的結構域(圖1：B)。KLF4的三級結構包含3個α-螺旋，每個α-螺旋中分布著1個鋅指結構(圖1：C)。系統(tǒng)發(fā)育樹表明大熊貓Klf4基因與北極熊Ursusmaritimus的親緣關系最近(圖2)。

2.2 Klf4基因在大熊貓不同組織中的表達分析

為探索KLF4在大熊貓不同組織中的功能，通過qPCR的方法檢測Klf4基因在大熊貓不同組織中的表達分布。結果發(fā)現(xiàn)，Klf4基因在睪丸中的表達量最高，其次是肺、脾臟、腎臟，而大腦、肝臟和心臟中的表達量相對較低(圖3)。

2.3 KLF4對大熊貓MSCs的調(diào)控

為了進一步了解KLF4在大熊貓骨髓MSCs中的作用，通過慢病毒感染的方法過表達了KLF4(圖4：A)，并在轉(zhuǎn)錄組水平上分析其調(diào)控作用。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)KLF4過表達后，大熊貓MSCs出現(xiàn)了179個差異表達基因，包括79個上調(diào)基因和100個下調(diào)基因(圖4：B)，這些差異表達基因的層次聚類分析結果見圖4：C。對這些差異基因進行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，差異性表達基因顯著富集在軍團桿菌病、Hippo信號通路、RNA轉(zhuǎn)運、TNF信號通路以及咖啡因代謝等通路(圖4：D)。

2.4 RNA-Seq結果的驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，通過qPCR分別對上調(diào)基因MYL6B、TMC8、TMEM200B、SLAIN1、SOCS3以及下調(diào)基因CASP10、P2RY10的表達情況進行了驗證(圖5：A)。同時，還有一些與細胞周期調(diào)控相關基因(Cyclin D1和P21)，以及與Klf4基因相互作用的Nestin、Pax6基因的表達情況(圖5：B)。qPCR結果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的結果保持一致，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可真實反映基因表達量的差異情況。

圖1 大熊貓Klf4基因的序列及結構特點Fig.1 Gene sequence and predicted protein structural characteristics of Klf4 gene in Ailuropoda melanoleucaA.大熊貓Klf4 cDNA全長序列及對應氨基酸序列，起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)以粗體表示，推測的多聚腺苷酸化信號(AATAAA)以黃色陰影顯示；B.KLF4蛋白的結構示意圖，SER Rich代表絲氨酸富集區(qū)，ZF代表鋅指結構域；C.預測的KLF4三級結構，包含3個α-螺旋，鋅指結構分布在每個α-螺旋中A.The full-length of giant panda Klf4 cDNA and corresponding amino acid sequences，the initiation codon (ATG)and stop codon (TAA)are characterized in bold，and the putative polyadenylation signal (AATAAA)is displayed with yellow shadow；B.schematic features of KLF4 protein，SER Rich represents serine enrichment region，ZF represents zinc finger domains；C.predicted tertiary structure of KLF4 containing 3 α-helices with a zinc finger

圖2 采用鄰接法構建不同物種KLF4的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of KLF4 from various species constructed using the neighbor-joining method

圖3 Klf4基因在大熊貓不同組織中的表達Fig.3 Relative expression levels of Klf4 gene in different tissues of Ailuropoda melanoleuca

圖4 KLF4對大熊貓間充質(zhì)干細胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用Fig.4 The regulatory function of KLF4 in Ailuropoda melanoleuca mesenchymal stem cells (MSCs)A.通過qPCR和Western blot檢測對照組(pLKO.3G)和KLF4過表達組(pLKO.Klf4)MSCs中KLF4的mRNA和蛋白表達水平；B.對照組和KLF4過表達組MSCs中差異表達基因(DEGs)的MA圖，紅、綠點分別代表上調(diào)、下調(diào)DEGs，黑色代表未發(fā)生改變的基因；C.對照組和KLF4過表達組MSCs中DEGs的聚類分析熱圖；D.對照組和KLF4過表達組MSCs中DEGs前20顯著富集的KEGG通路；* P<0.05，** P<0.01A.MSCs were infected with control lentivirus (pLKO.3G)and KLF4 overexpression lentivirus (pLKO.Klf4)，and then the mRNA and protein expression levels of KLF4 were measured by qPCR and Western blot；B.MA Plot of differentially expressed genes (DEGs)between pLKO.3G MSCs vs.pLKO.Klf4 MSCs；red，green and black dots represent up-regulated DEGs，down-regulated DEGs and unchanged genes，respectively；C.Heatmap clustering of DEGs between pLKO.3G MSCs vs.pLKO.Klf4 MSCs based on overall expression similarity；D.top 20 significantly enriched KEGG pathways of the DEGs between pLKO.3G MSCs vs.pLKO.Klf4 MSCs based on P-value；*P<0.05，** P<0.01

圖5 對照組(pLKO.3G)和KLF4過表達組(pLKO.Klf4)中上、下調(diào)DEGs的qPCR驗證Fig.5 qPCR verification of up- and down-regulated DEGs between pLKO.3G vs.pLKO.Klf4A.重要的DEGs表達量的qPCR驗證；B.細胞周期調(diào)控相關基因及與KLF4互作的基因表達量的qPCR驗證；* P<0.05，** P<0.01A.qPCR was employed to verify the expression of some important DEGs；B.the genes associated with cell cycle and KLF4；*P<0.05，** P<0.01

3 討論

本研究從大熊貓MSCs中克隆獲得了大熊貓Klf4基因cDNA全長，共2 431 bp，編碼479個氨基酸。大熊貓KLF4的N端比人、鼠的少9個氨基酸殘基，而C端具有KLF家族高度保守的C2H2結構，該結構介導KLF4與靶DNA或蛋白的結合。Klf4基因在大熊貓睪丸中的表達量最高，表明Klf4基因可能參與調(diào)控其中重要的生理過程，如精子的發(fā)生過程(Yangetal.，2017)；此外，Klf4基因在脾臟、腎臟中的表達也較高，表明Klf4基因在脾臟、腎臟中可能同樣也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，如KLF4會影響腎足狀突細胞的表型和功能(Kaorietal.，2014)。KLF4在大熊貓不同組織中的分布差異可能是機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控的結果。

基于轉(zhuǎn)錄組測序結果分析，在大熊貓MSCs中過表達KLF4后，差異表達基因最顯著富集在軍團桿菌病代謝通路。KLF4可能通過影響大熊貓MSCs中真核翻譯延伸因子1α(eEF1A)的表達進而影響軍團桿菌病代謝。eEF1A是一個多功能蛋白，在蛋白質(zhì)的翻譯延伸、細胞凋亡、細胞信號轉(zhuǎn)導以及心血管疾病發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用(Khachoetal.，2008)。KLF4調(diào)控eEF1A1和eEF1A3的表達發(fā)生改變，進而引起軍團桿菌病代謝的改變。

KLF4可顯著影響大熊貓MSCs中的RNA轉(zhuǎn)運過程。轉(zhuǎn)錄組結果表明，KLF4可顯著下調(diào)輸出蛋白XPOT的表達。XPOT參與成熟tRNA從細胞核到細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運過程(Guptaetal.，2016)。XPOT的表達量減少，因此與它的錨定蛋白RanGTP的結合減少，導致tRNA轉(zhuǎn)運過程中的能量供應不足，進而影響細胞核與細胞質(zhì)中RNA的運輸。

此外，在KLF4過表達后，腫瘤抑制基因LATS1的表達量減少。LATS1是Hippo信號通路的重要組成成分，已有研究表明，低表達的LATS1會抑制Hippo信號通路，進而影響小鼠MSCs的增殖、遷移和分化過程(Qiuetal.，2015)。類似的，在大熊貓MSCs中，KLF4可能通過下調(diào)LATS1的表達，抑制Hippo信號通路。

與之前的報道不同(Wassmannetal.，2007；Chenetal.，2011)，在大熊貓MSCs中，KLF4可通過上調(diào)細胞周期蛋白cyclin D1同時下調(diào)細胞周期激酶抑制基因P21的表達來促進細胞增殖。同時，KLF4可能通過影響細胞凋亡相關基因CASP10和TMC8的表達而參與調(diào)控大熊貓MSCs的凋亡過程。

本研究結果進一步揭示KLF4在大熊貓MSCs中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，后續(xù)可深入研究其具體的調(diào)控機制。本文擴展了大熊貓分子水平的相關研究，為今后的相關研究提供了理論依據(jù)，為大熊貓遺傳資源的保護和利用提供了更多的思路。